Wykorzystanie optycznej tomografii koherentnej i odpowiedzi optokinetycznej jako strukturalnych i funkcjonalnych odczytów układu wzrokowego u myszy i szczurów
10 stycznia 2019
Przedstawiono szczegółowy protokół oceny odczytów strukturalnych i wizualnych u gryzoni za pomocą optycznej koherentnej tomografii i odpowiedzi optokinetycznej. Wyniki dostarczają cennych informacji dla badań okulistycznych i neurologicznych.
Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny neurologii i okulistyki oraz pomóc w ocenie dużej różnorodności retinopatii i objawów siatkówkowych w różnych modelach gryzoni. Główną zaletą tych technik jest to, że można przeprowadzać nieinwazyjne badania podłużne, co zmniejsza zmienność i liczbę zwierząt potrzebnych do eksperymentów. Metody te umożliwiają ilościowe badanie struktury i funkcji in vivo, które można wykorzystać do badania stanów patologicznych lub do oceny potencjalnej użyteczności nowych środków terapeutycznych.
Jednak szczególnie zastosowanie technologii optycznej koherentnej tomografii w modelach gryzoni jest nadal trudne, głównie ze względu na mały rozmiar oka. Procedury zademonstruje Michael Dietrich, doktorant z naszego laboratorium. Po znieczuleniu gryzonia nałóż jedną kroplę tropikamidu fenylefryny na każde oko w celu rozszerzenia źrenic.
Po minucie zetrzyj nadmiar mokrej kropli do oczu. I smaruj oczy żelem okulistycznym na bazie metylocelulozy, aby uniknąć wysuszenia oka i zmętnienia rogówki. Następnie użyj kleszczyków, aby umieścić niestandardową soczewkę kontaktową na oku.
Naciśnij przycisk Start w prawym rogu wyświetlacza panelu sterowania, aby uruchomić tryb akwizycji. Następnie, aby zobrazować lewe oko, ustaw uchwyt tak, aby żarówka lewego oka gryzonia była skierowana w stronę aparatu. Ustaw poziom filtra na R i wybierz BR i OCT dla obrazowania dna oka niebieskich odbić i akwizycji B-scan w oprogramowaniu.
Następnie ustaw odległość ustawiania ostrości na około 38 dioptrii za pomocą pokrętła ostrości z tyłu aparatu. I powiększ siatkówkę, aż skan OCT będzie widoczny na ekranie. Następnie, aby zapewnić ścieżkę wiązki przez środek źrenicy, z ortogonalnym kątem siatkówki we wszystkich płaszczyznach, należy ustawić tarczę nerwu wzrokowego w środku oświetlanego pola.
I dostosuj poziome i pionowe skany B linii do poziomu poziomego, obracając uchwyt. Na ekranie oprogramowania wybierz tryb skanowania woluminu i ustaw go na 25 skanów B w trybie wysokiej rozdzielczości przy 50 automatycznym śledzeniu w czasie rzeczywistym. Wyśrodkuj środek siatki skanowania woluminu na dysku optycznym i rozpocznij akwizycję, naciskając pokrętło czarnej czułości, a następnie Acquire na panelu sterowania.
Po zakończeniu akwizycji ustaw poziom filtra na A.Wybierz opcję Niebieska autofluorescencja na panelu sterowania. I dostosuj jasność obrazu za pomocą pokrętła czułości. Naciśnij pokrętło czułości, a następnie Aprykcja, aby zobrazować komórki fluorescencyjne lub osady autofluorescencyjne.
Do analizy skanów woluminów użyj automatycznej segmentacji oprogramowania urządzenia OCT, klikając skanowanie prawym przyciskiem myszy. I wybierz Segmentacja, a następnie Wszystkie warstwy. Wykonaj ręczną korektę warstw, klikając dwukrotnie żądany skan.
Wybierz Profil grubości. I kliknij Edytuj segmentacje warstw. Zaznaczaj jedną warstwę na raz.
W razie potrzeby popraw zieloną linię, przesuwając czerwone kropki, przeciągając i upuszczając we właściwe miejsce. Następnie wybierz zakładkę Mapa grubości. Wybierz siatkę ETDRS o średnicy 1, 2, 3 milimetrów.
Wyśrodkuj wewnętrzny okrąg na tarczy nerwu wzrokowego. Na koniec oblicz grubość warstw siatkówki na podstawie wartości grubości dostarczonych przez oprogramowanie dla różnych sektorów siatkówki będących przedmiotem zainteresowania. Aby obliczyć główne wartości grubości ze skanów objętościowych, użyj całej 1, 2, 3 milimetrowej siatki ETDRS, która obejmuje kąt około 25 stopni, z wyłączeniem wewnętrznego okręgu o długości jednego milimetra, który zawiera tarczę nerwu wzrokowego.
Zacznij od wybrania platformy do pomiaru gryzoni. Otwórz okno Ustawienia wstępne, klikając dwukrotnie oprogramowanie. Wybierz pozycję Nowa grupa i wybierz nazwę grupy, liczbę obiektów, gatunki i szczepy.
Z menu rozwijanego wybierz bodziec zmienny, częstotliwość czasoprzestrzenną, czułość kontrastu, prędkość lub orientację i naciśnij Utwórz nową grupę. Ustaw ostrość na platformie, manipulując pierścieniem ostrości aparatu na górze komory. I skalibruj system, wyrównując czerwone kółko wokół czarnego koła na platformie.
Następnie umieść gryzonia na platformie i pozwól mu przystosować się do środowiska przez około pięć minut. Następnie rozpocznij pomiar, wybierając strzałkę w lewo dla tak lub kwadrat dla nie, jeśli zwierzę odpowiednio śledzi lub nie śledzi. Ręcznie wybierz rozmiar kroku bodźca, klikając strzałki w górę i w dół obok bodźca zmiennego.
Na koniec wybierz kartę Podsumowanie i kliknij Plik, Eksportuj tabelę lub Wykres, aby wyeksportować żądany zestaw danych. Wyniki wskazują, że zmniejsza się degeneracja wewnętrznych warstw siatkówki. Kliniczny wynik EAE jest osłabiany podczas kursu EAE, gdy podawano substancję 1.
Co więcej, OKR ujawnia poprawę ostrości wzroku u zwierząt leczonych substancją 1 w porównaniu z nieleczonymi myszami MOG EAE, mierzoną za pomocą testów progów częstotliwości przestrzennej przez okres 120 dni. Podczas wykonywania pomiarów OCT krytycznym krokiem jest ortogonalna orientacja wiązki laserowej we wszystkich płaszczyznach w stosunku do siatkówki, aby zapewnić jakość i powtarzalność wartości grubości. W przypadku techniki OKR rozróżnienie między śledzeniem a normalnymi ruchami behawioralnymi zwierzęcia wymaga pewnego przeszkolenia badacza.
Ważne jest, aby być zaślepionym dla grupy eksperymentalnej. Po tych badaniach strukturalnych i funkcjonalnych uszkodzeń występujących w kontekście eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego, procedura może być również pomocna w innych modelach obejmujących układ wzrokowy, w tym między innymi w modelach retinopatii lub uszkodzenia nerwu wzrokowego. Techniki te torują drogę do badań in vivo w dziedzinie neurologii i okulistyki i można je łatwo przenieść do badań klinicznych.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia kompleksowy protokół oceny parametrów strukturalnych i wizualnych w modelach gryzoni z wykorzystaniem optycznej koherentnej tomografii (OCT) oraz odpowiedzi optokinetycznej (OKR). Te nieinwazyjne techniki dostarczają danych przydatnych zarówno w badaniach okulistycznych, jak i neurologicznych, umożliwiając prowadzenie badań podłużnych przy zmniejszonej zmienności i mniejszej liczbie zwierząt doświadczalnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Oftalmologia
- Modele gryzoni
Wstęp
- Badanie koncentruje się na ocenie retinopatii oraz manifestacji siatkówkowych u gryzoni.
- Zwraca ono uwagę na trudności związane z zastosowaniem OCT ze względu na niewielki rozmiar oczu gryzoni.
- OCT i OKR umożliwiają ilościowe badanie in vivo struktury i funkcji siatkówki.
- Metody te dostarczają cennych danych do oceny potencjalnych terapii oraz zrozumienia stanów patologicznych.
Cel badania
- Opracowanie i zaprezentowanie protokołu wykorzystania OCT i OKR w badaniach nad gryzoniami.
- Zbadanie uszkodzeń strukturalnych i funkcjonalnych w kontekście eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE).
- Ocena skuteczności nowych substancji leczniczych w modelach przedklinicznych.
Zastosowane metody
- Gryzonie poddano znieczuleniu w celu zapewnienia komfortu podczas procedur OCT i OKR.
- Obrazowanie OCT przeprowadzono przy użyciu specjalistycznej soczewki kontaktowej i odpowiednich ustawień oprogramowania dla skanów o wysokiej rozdzielczości.
- Platforma OKR polegała na prezentacji różnych bodźców w celu oceny zdolności śledzenia wzrokowego.
- Kluczowe etapy obejmowały staranną kalibrację oraz procedury akwizycji, aby zapewnić wiarygodne wyniki obrazowania i śledzenia.
Główne wyniki
- Wyniki wykazały zmniejszoną degenerację wewnętrznych warstw siatkówki u leczonych gryzoni.
- U leczonych zwierząt zaobserwowano poprawę ostrości wzroku w porównaniu z nieleczoną grupą kontrolną.
- Dane sugerują, że techniki te pozwalają na wiarygodny pomiar zmian w siatkówce oraz funkcji wzroku w czasie.
Wnioski
- Niniejsze badanie wykazuje użyteczność OCT oraz OKR jako potężnych narzędzi w badaniach in vivo w neurologii i okulistyce.
- Uzyskane wyniki umożliwiają dalsze zgłębianie patologii siatkówki oraz ocenę nowych interwencji terapeutycznych.
- Przedstawione metodologie mogą w znacznym stopniu przyczynić się do projektowania badań klinicznych i lepszego zrozumienia zaburzeń układu wzrokowego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Połączenie odczytów strukturalnych i funkcjonalnych układu wzrokowego umożliwia podłużną, ilościową ocenę integralności siatkówki i funkcji wzrokowych w modelach gryzoni, co wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka w przedklinicznych programach neurologicznych i okulistycznych. To podejście dwumodalne zmniejsza zmienność eksperymentalną oraz liczbę wykorzystanych zwierząt, zapewniając jednocześnie przekładalne punkty końcowe do oceny terapeutyków neuroprotekcyjnych lub modyfikujących przebieg choroby. Przedstawiona metodologia zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez korelację strukturalnych zmian w siatkówce z funkcjonalnymi wynikami wzrokowymi w różnych modelach chorobowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe określenie grubości warstw siatkówki jako strukturalnego biomarkera neurodegeneracji lub neuroprotekcji.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalne, nieinwazyjne odczyty strukturalne, które wspierają funkcjonalną walidację celów w modulacji szlaku wzrokowego.
- Wartość prognostyczna: Koreluje zmiany strukturalne siatkówki otrzymane za pomocą OCT z ostrością wzroku mierzoną metodą OKR, aby zwiększyć pewność co do zaangażowania celu i modulacji szlaku.
Przesiewanie i opracowanie analizy
- Gotowość do analizy: Ustanawia zestandaryzowane procedury OCT i OKR dla ilościowego obrazowania in vivo oraz śledzenia behawioralnego, co umożliwia wiarygodny screening związków.
- Powtarzalność: Ułatwia podłużne śledzenie struktury i funkcji siatkówki, zmniejszając zmienność między zwierzętami i poprawiając precyzję analizy.
- Skalowalność: Wspiera adaptację do wysokoprzepustowości dzięki konfigurowalnym parametrom bodźców i automatycznej segmentacji, zapewniając spójne wyniki danych w różnych badaniach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Wykazuje przydatność w modelach autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE), łącząc zachowanie struktury siatkówki z funkcjonalną poprawą widzenia i łagodzeniem objawów klinicznych.
- Ciągłość translacyjna: Zapewnia pomost od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej poprzez pomiar zarówno neurodegeneracji siatkówki, jak i regeneracji funkcji wzrokowej w dłuższych okresach.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), wykazując indukowane przez substancję zmniejszenie degeneracji wewnętrznych warstw siatkówki oraz poprawę progów częstotliwości przestrzennej w ciągu 120 dni.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania leków, od walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po przedkliniczne badania skuteczności, dostarczając punktów końcowych o charakterze strukturalnym i funkcjonalnym, które pozwalają ocenić aktywność biologiczną oraz potencjał terapeutyczny.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez umożliwienie ilościowych badań in vivo struktury i funkcji siatkówki w modelach neurodegeneracji i neuroprotekcji.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy, powtarzalne mapy grubości strukturalnej oraz wskaźniki śledzenia funkcjonalnego w celu wiarygodnej oceny związków w testach układu wzrokowego.
- Analityka: Generuje profile grubości specyficzne dla poszczególnych warstw oraz progi częstotliwości przestrzennej, które umożliwiają porównania między różnymi warunkami oraz analizę zależności dawka-odpowiedź.
- Badania translacyjne: Łączy zachowanie struktury siatkówki z funkcjonalną regeneracją ostrości wzroku, wspierając dopasowanie biomarkerów i ciągłość przedkliniczną w modelach chorób neurologicznych.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę do podłużnej oceny układu wzrokowego w wielu wskazaniach chorobowych i modalnościach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki skorelowanym odczytom strukturalnym i funkcjonalnym systemu wzrokowego.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność dzięki skalibrowanym protokołom obrazowania oraz ślepym procedurom śledzenia behawioralnego.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczenie wczesnych, translacyjnych biomarkerów zmian funkcji siatkówki i wzroku, co zmniejsza ryzyko biologiczne w późnych etapach badań.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów w oparciu o dostosowane do ryzyka kryteria, wykazując zarówno zachowanie struktury siatkówki, jak i poprawę funkcji wzrokowych w modelach przedklinicznych.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z gryzoniami, przygotowaniu okulistycznym oraz obsłudze systemu OCT/OKR w celu wiarygodnego pozyskiwania danych.
- Zależność od spersonalizowanych uchwytów, soczewek kontaktowych i skalibrowanych systemów obrazowania w celu dostosowania do małego rozmiaru oka gryzoni oraz zapewnienia prawidłowego wyrównania wiązki.
- Konieczność standaryzacji procedur znieczulenia, rozszerzania źrenic, nawilżania i obrazowania między zespołami w celu zachowania spójności w różnych ośrodkach lub badaniach.
- Uwzględnienie kwestii adaptacyjnych dla różnych parametrów bodźca (częstotliwość czasoprzestrzenna, kontrast, prędkość) w testach OKR dla różnych gatunków i modeli szczepów.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak potrzeba przeszkolenia badaczy w celu odróżnienia prawdziwego śledzenia optokinetycznego od normalnych ruchów behawioralnych oraz zapewnienie zaślepienia podczas oceny.
