Wykorzystanie obrazowania o wysokiej zawartości do ilościowego określenia zaangażowania celu w przylegających komórkach

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii chemicznej i odkrywania leków. Na przykład, czy twój związek wiąże się z białkiem docelowym? Główną zaletą tej techniki jest to, że nie ma potrzeby odłączania przylegających komórek.

A lokalizację przestrzenną można określić za pomocą obrazowania. Chociaż zastosowaliśmy tę metodę w liniach komórkowych, możliwe jest również zastosowanie tej metody do innych systemów komórkowych, takich jak kultury pierwotne i kokultury. Przed wysiewem komórek umieść czarne 384-dołkowe płytki do obrazowania w kapturze do hodowli tkankowych i przykryj płytki folią aluminiową przed użyciem standardowego wiertła, aby wykonać trzy otwory o średnicy 3,5 milimetra na obu końcach każdej płytki.

Gdy płytki są gotowe, należy zastosować technikę aseptyczną, aby przemyć kulturę komórkową A-431 za pomocą 5 do 10 mililitrów PBS. I inkubuj komórki z dwoma mililitrami trypsyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż komórki się oderwą. Po zliczeniu rozcieńczyć komórki do 5 razy 10 do 4 komórek na mililitr w pożywce hodowlanej i zasiać 40 mikrolitrów komórek do każdego dołka każdej płytki testowej.

Delikatnie potrząśnij każdą płytką z boku na bok po wysianiu, aby zapewnić jednorodne rozmieszczenie komórek na dnie studzienki. Aby zminimalizować wpływ krawędzi płytki, pozwól komórkom osiąść na dnie płytek testowych przez 20 minut w temperaturze pokojowej z tyłu okapu z przepływem laminarnym przed umieszczeniem płytek w niestandardowej wilgotnej komorze na dwa do trzech dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. W dniu eksperymentu użyj podkładki do płytek, aby zassać pożywkę z każdej studzienki.

I dodać 30 mikrolitrów interesującego związku o odpowiednim stężeniu doświadczalnym do odpowiednich studzienek doświadczalnych. Uszczelnić płytki testowe poddane działaniu związków za pomocą oddychających uszczelek płytowych. I włóż płytki z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych na 30 minut.

Aby wystawić komórki na próbę cieplną, najpierw ustaw łaźnię wodną na odpowiednią temperaturę doświadczalną i umieść w kąpieli nieuszczelnioną atrapę płytki zawierającą taką samą objętość pożywki na studzienkę, jak płytkę testową, wraz z termometrem termoparowym do monitorowania temperatury w studzienkach. Po osiągnięciu odpowiedniej temperatury doświadczalnej należy zdjąć oddychającą uszczelkę z każdej płytki testowej i ponownie uszczelnić płytki szczelnie przylegającą folią aluminiową, aby upewnić się, że woda nie przedostanie się do studzienek podczas ich późniejszego ogrzewania w łaźni wodnej. Zapewnienie dostępu do wywierconych otworów w ramie płyty.

Umieścić płytki testowe i nową atrapę płytki w łaźni wodnej, tak aby dno płytki było ustawione pod kątem w kierunku powierzchni wody, aby wypchnąć pozostałe powietrze spod płytek, i rozpocznij monitorowanie temperatury nowej płytki atrapy. Równomierne nagrzewanie płytki ma kluczowe znaczenie dla wydajności testu. Uważaj, aby umieścić płytkę w łaźni wodnej w taki sposób, aby pod spodem nie było uwięzionych pęcherzyków powietrza.

Po trzech minutach natychmiast schłodzić płytki w drugiej łaźni wodnej z wodą o temperaturze pokojowej przez pięć minut przed ich analizą. Aby zobrazować komórki, najpierw dodaj 10 mikrolitrów 16% paraformaldehydu bezpośrednio do płytek testowych na 20-minutową inkubację w temperaturze pokojowej. Pod koniec okresu utrwalania przemyć komórki 300 mikrolitrami PBS na myjce płytkowej i dodać 20 mikrolitrów 0,1% NP40 na 10-minutową inkubację w temperaturze pokojowej.

Pod koniec inkubacji umyć komórki, jak pokazano. I zablokuj komórki 15 mikrolitrami 1% albuminy surowicy bydlęcej lub BSA na jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie użyj podkładki do płytki, aby zassać surowicę blokującą i dodać 10 mikrolitrów pierwotnego przeciwciała będącego przedmiotem zainteresowania do odpowiednich studzienek na jednogodzinną inkubację w temperaturze pokojowej.

Pod koniec inkubacji przemyć każdą studzienkę 300 mikrolitrami PBS i oznaczyć komórki 10 mikrolitrami odpowiedniego przeciwciała wtórnego przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem. W celu barwienia jądrowego komórek dodaj 10 mikrolitrów odpowiedniego barwnika jądrowego do każdej studzienki przez 10 minut w temperaturze pokojowej. I umyj komórki w PBS, jak pokazano.

Oznacz komórki 10 mikrolitrami maski komórkowej na studzienkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie następuje ostatnie mycie PBS. Następnie dozuj 60 mikrolitrów świeżego PBS do każdej studzienki i uszczelnij płytki folią aluminiową do czasu obrazowania.

Aby zobrazować komórki, należy przechwycić cztery obrazy na studzience na imagerze o wysokiej zawartości przy użyciu odpowiednich kanałów fluorescencyjnych pod 10-krotnym obiektywem za pomocą automatycznego laserowego autofokusa i zastosować binning podczas akwizycji. Następnie zapisz obrazy jako 16-bitowe pliki dot-tiff w skali szarości wraz z metadanymi. Rozpoznawanie przeciwciał nie powinno być zakłócone przez zmiany konformacyjne w białku docelowym, które mogą być wywołane przez wiązanie ligandów.

Na przykład BIRB796 ma długi współczynnik odchyleń, a kwantyfikacja docelowego zaangażowania jest możliwa tylko poprzez zastosowanie etapu pobierania antygenu. Ten reprezentatywny eksperyment z krzywą agregacji termicznej dla komórek traktowanych pozytywnymi i ujemnymi związkami kontrolnymi ilustruje typowe zakresy stabilizacji białek po potraktowaniu komórek związkami w różnych temperaturach. Tutaj pokazano typowy izotermiczny eksperyment odcisku palca dawka-odpowiedź, aby wykazać reprezentatywne zakresy stabilizacji białka w odpowiedzi na różne dawki eksperymentalnego związku.

Zastosowanie izotermicznych wyzwań cieplnych do badań przesiewowych związków w celu identyfikacji nowych spoiw białka docelowego pozwala na analizę dużej liczby związków w jednym stężeniu w tym samym czasie, przed izotermicznym odciskiem palca dawka-odpowiedź trafień w celu potwierdzenia stabilizacji białka docelowego. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że dokładne warunki eksperymentalne, takie jak długość i temperatura wyzwania cieplnego, wpływają na obserwowaną siłę działania związków. Nie zapominaj, że praca z paraformaldehydem może być bardzo niebezpieczna.

Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak przestrzeganie instytucjonalnych wytycznych dotyczących bezpieczeństwa.