Identyfikacja funkcjonalnych regionów białkowych poprzez budowę białek chimerycznych

Zamiana regionów strukturalnie podobnych białek w celu stworzenia kimer pozwala nam zbadać znaczenie regionów odpowiedzialnych za funkcje biologiczne badanej cząsteczki. Wymiana regionów poprzedza ogólną drugorzędową strukturę białka, dzięki czemu region ważny dla jego ogólnej struktury może być odróżniony od tych bezpośrednio pośredniczących w funkcjach biologicznych. Może zamieniać się w wybieranie dokładnych regionów do zastąpienia.

Rozpoczęcie od większych wymian jest zwykle pomocne w zidentyfikowaniu kluczowej funkcjonalności białka. Aby rozpocząć procedurę, wybierz odpowiednie białko jako dawcę, aby wymienić regiony z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania, jak opisano w protokole tekstowym. Następnie należy uzyskać sekwencje aminokwasów białkowych białek biorcy i dawcy z bazy danych sekwencji referencyjnych, uzyskując najpierw dostęp do sekcji genów na stronie internetowej ref seq.

Wpisz nazwę interesującego Cię białka w polu wyszukiwania i kliknij przycisk wyszukiwania. Kliknij nazwę genu dla żądanego gatunku na wyświetlonej liście. Przewiń w dół do sekcji ref seq, aby zobaczyć wszystkie udokumentowane izoformy.

Kliknij identyfikator sekwencji dla interesującej nas izoformy. Przewiń w dół i kliknij cds, aby podświetlić region kodujący białko genu. W prawym dolnym rogu ekranu kliknij FAFSDA i skopiuj sekwencję genu.

Zapisz sekwencję DNA za pomocą odpowiedniego oprogramowania do edycji DNA. Korzystając z ogólnodostępnego APE, otwórz program, wklej skopiowaną sekwencję w pustym polu, wybierz nazwę sekwencji i kliknij Zapisz. Teraz wybierz regiony białkowe, które mają zostać podstawione w różnych konstruktach kimerycznych, najpierw dzieląc interesującą sekwencję białka na odrębne regiony strukturalne.

W tym celu należy pobrać dane strukturalne interesującego nas białka ze strony internetowej PDBe. Wejdź na stronę PDBe dla białka i pobierz plik PDBe, klikając pobierz po prawej stronie ekranu. Otwórz plik PDBe w systemie wizualizacji molekularnej, takim jak Pymol.

W Pymol wyświetl sekwencję nukleotydów, ukryj domyślne dane strukturalne i wybierz widok kreskówki, aby wyraźnie zwizualizować cechy strukturalne białka. Kliknij sekwencję nukleotydów u góry ekranu, aby podświetlić różne części cząsteczki, zwracając uwagę na aminokwasy odpowiadające każdej charakterystycznej cesze strukturalnej. Teraz opisz różne regiony strukturalne w sekwencji DNA w APE, otwierając sekwencję DNA, wybierając ją i klikając ORF translować, a następnie kliknij ostatni aminokwas pierwszego regionu, aby podkreślić jego pozycję w sekwencji DNA i wybierz kodowanie nukleotydu dla tego regionu.

Kliknij zaznaczenie prawym przyciskiem myszy i wybierz nową funkcję, aby nadać jej nazwę i kolor. Powtórz ten proces dla każdego obszaru strukturalnego zidentyfikowanego w poprzednim kroku. Aby wyrównać sekwencje reszt dwóch białek, najpierw uzyskaj pełne sekwencje aminokwasów białek donorowych i receptorowych w APE.

Tak jak poprzednio, otwórz sekwencję DNA dawcy, wybierz ją i kliknij ORF-y translate. Następnie wejdź na stronę internetową Clustal Omega, a następnie umieść sekwencje aminokwasów dwóch białek. Każda sekwencja powinna być poprzedzona linią tekstową z nazwą białka, aby mogła być prawidłowo zidentyfikowana.

Przewiń w dół i kliknij Prześlij. Pobierz plik wyrównania, klikając kartę Pobierz plik wyrównania i zapisz go. Plik ten można otworzyć za pomocą dowolnego programu do edycji tekstu.

Używając pliku wyrównania jako odniesienia, opisz odpowiednie regiony strukturalne białka dawcy w ich sekwencji DNA. Utwórz kopię opisanej sekwencji DNA białka receptorowego i zmień jej nazwę na białko kimeryczne. Otwórz sekwencję DNA o zmienionej nazwie w APE.

Wybierz region do wymiany w białku dawcy, a następnie wybierz odpowiedni region w białku receptorowym o zmienionej nazwie. Wklej sekwencję DNA białka dawcy, a następnie zapisz zmiany. Zaprojektuj końcowe startery za pomocą edytora DNA, takiego jak APE.

Utwórz nowy plik DNA, zainicjuj końcowy starter końcowy sekwencją prowadzącą. Następnie następuje pierwsze miejsce restrykcyjne wybrane w wektorach MCS i opcjonalny odstęp w początkowych 18 do 27 parach zasad interesującego genu. W nowym pliku DNA zaprojektuj sekwencję startera C-końcowego tak, aby zaczynała się od końcowych 18 do 27 par zasad genu będącego przedmiotem zainteresowania, a następnie opcjonalnego dystansu, drugiego wybranego miejsca restrykcyjnego i sekwencji lidera.

Zaznacz całą sekwencję, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz odwrócony komplement, aby uzyskać odwrotny podkład. Teraz zaprojektuj elementarze dla każdego z regionów granicznych w konstruktach kimerycznych. W sekwencji DNA kimery podkreśl region 30 par zasad w strefie, w której stykają się sekwencje oryginalne i wstawione.

Składa się z 15 par zasad w każdej sekwencji. Skopiuj region i wklej go do nowego pliku DNA. Ta sekwencja będzie podstawowym elementarzem.

Utwórz kopię startera do przodu wygenerowanego w poprzednim kroku i zmień jego nazwę na starter odwrotny. Podświetl sekwencję starterów, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz odwrotny komplement, aby wygenerować odwrotną sekwencję starterów. Powtórz te kroki dla każdej strefy kontaktu w sekwencji kimerycznego DNA.

Ogólnie rzecz biorąc, do wytworzenia jednej kimery wymagane są dwa zestawy starterów do przodu i do tyłu, chyba że wymiana następuje w regionach końcowych N lub C. Przygotować indywidualną mieszaninę reakcyjną PCR dla każdego z fragmentów składających się na białko kimeryczne. Najpierw ustaw jednopunktową pięciomililitrową rurkę z mikrobezpiecznikiem na lodzie i odpipetuj różne odczynniki mieszanin PCR w kolejności podanej w protokole tekstowym.

Upewnij się, że dla każdej reakcji PCR stosowane są odpowiednie startery i matryce. Oznaczyć dwie cienkościenne probówki do PCR w punkcie zerowym w dwóch mililitrach dla każdej reakcji i przenieść 20 mikrolitrów odpowiedniej mieszaniny PCR do każdej probówki. Przenieś probówki PCR do termocyklera PCR i zainicjuj protokół zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Po zakończeniu reakcji PCR dodaj cztery mikrolitry sześciokrotnego buforu ładującego DNA do każdej probówki. Wprowadzić jednoprocentowy żel agarozowy do urządzenia do elektroforezy i przykryć buforem TAE. Ostrożnie załaduj próbki do żelu wraz z później o masie cząsteczkowej.

Po uruchomieniu żelu pod napięciem od 80 do 120 woltów przez 20 do 45 minut wyłącz jednostkę do elektroforezy i usuń żel agoross. Wizualizuj amplifikowane prążki DNA w świetle UV. Za pomocą żyletki wytnij pojedyncze fragmenty DNA z żelu i przenieś je do oznaczonych dwóch mililitrowych probówek z mikrobezpiecznikami.

Po użyciu zestawu do czyszczenia PCR w celu oczyszczenia fragmentów DNA, określ ilościowo ilość odzyskanego DNA, mierząc absorbancję próbek przy 260 nanometrach i 340 nanometrach w spektrofetometrze. Teraz wykonaj amplifikację PCR, aby wygenerować kimeryczną sekwencję DNA. Najpierw ustaw 50 mikrolitrów reakcji PCR, aby połączyć oddzielne składniki kimery, tak jak poprzednio.

Zastosuj startery końca N i C, wraz z 10 nanogramami każdego z amplifikowanych fragmentów DNA. Odzyskaj i oznacz ilościowo oczyszczony fragment DNA jak poprzednio, w 30 mikrolitrach wody wolnej od jądra. Fragment ten zawiera kimeryczną sekwencję DNA otoczoną miejscami restrykcyjnymi zawartymi w końcowych starterach.

Przykładem wytwarzania białka kimerycznego są dwaj członkowie rodziny inter luke i sześciu sytokin. Oncostaten M w czynniku hamującym białaczkę. Kimera windy OSM powstaje w wyniku zamiany obszaru pętli BC OSM na odpowiadającą mu sekwencję windy.

Pierwszy etap amplifikacji PCR składał się z trzech oddzielnych reakcji. N-końcowy fragment OSM, który wymagał N-terminalnych starterów OSM do przodu i BC start odwrotny, używał OSM jako szablonu. Pętlę LIF BC uzyskano za pomocą starterów BC start forward i BC N reverse przy użyciu LIF jako szablonu.

Fragment OSM C-terminala używał starterów BC end forward i C terminal odwrotny OSM, a także OSM jako szablonu. Te oczyszczone fragmenty zostały następnie użyte jako matryca w drugiej reakcji PCR wraz z N-końcowymi starterami OSM do przodu i C-końcowymi starterami odwróconymi OSM w celu amplifikacji odpowiedniej sekwencji genu pętli OSM LIF, BC. Po oczyszczeniu i przekształceniu w e-coli, poszczególne plazmidy wyizolowano i poddano badaniom przesiewowym za pomocą trawienia enzymem restrykcyjnym w celu prawidłowego wprowadzenia fragmentu DNA.

Elektroforeza żelowa ujawniła dodatnie trafienia, które następnie zostały wysłane do weryfikacji sekwencji. Białka kimeryczne muszą być produkowane, a aktywność mierzona w doskonałych układach frakcyjnych. W celu określenia znaczenia zastąpionych regionów dla tej konkretnej frakcji.

Technika ta była bardzo przydatna i często stosowana, zakłócana przez receptory sygnałowe w celu identyfikacji kluczowych domen funkcyjnych i miejsc rozpoznawania receptorów. Liczba, której używam do elektroforezy DNA, powinna być obsługiwana przy użyciu jednorazowych rękawiczek, fartucha laboratoryjnego i okularów ochronnych.