Izolacja pojedynczych wewnątrzkomórkowych zbiorowisk bakteryjnych wygenerowanych z mysiego modelu infekcji dróg moczowych do dalszej analizy pojedynczych komórek
16 kwietnia 2019
Ten protokół opisuje prostą metodę izolowania pojedynczych, zainfekowanych komórek nabłonka pęcherza moczowego od mysiego modelu infekcji dróg moczowych.
Wewnątrzkomórkowe społeczności bakteryjne lub IBC zaobserwowano u myszy, które poddano eksperymentalnym infekcjom dróg moczowych lub ZUM. Zaobserwowano je również w osadach moczu pacjentów z ZUM. Technika, którą dzisiaj opisujemy, to sposób na izolację pojedynczych IPC od eksperymentalnie zakażonych myszy.
Technika mikropipetowania jamy ustnej jest jedyną obecnie dostępną techniką izolowania bakterii wewnątrzkomórkowych z zakażonych pęcherzy myszy. Aby przygotować pipety ze szklanymi ustami, mocno ściśnij oba końce szklanej rurki kapilarnej i równomiernie obracaj środek rurki w przód iw tył wzdłuż jej osi nad otwartym źródłem płomienia. Gdy szkło stanie się miękkie, usuń kapilatę ze źródła ciepła i natychmiast rozsuń szklankę.
Idealna końcowa długość naciągniętej kapilary jest od trzech do pięciu centymetrów dłuższa niż kapilary nienaciągnięta, aby zapewnić odpowiednią średnicę wewnętrzną do izolacji pojedynczych komórek nabłonka pęcherza moczowego. Gdy szklanka ostygnie, sprawdź, czy środek szklanej kapilary jest węższy i czy wnętrze rurki jest nadal puste. Podnosząc jedną ręką duży koniec naciągniętej kapilary, użyj kleszczyków, aby chwycić kapilarnę w najwęższym miejscu, upewniając się, że kleszcze są trzymane z wystarczającą siłą, aby mocno chwycić kapilatę bez jej zgniatania.
Szybko przekręć kleszcze, aby zatrzasnąć naciągniętą kapilarnę w najwęższym miejscu. Następnie umieść kapilarnę wielkości mikropipety w jamie ustnej na 100-milimetrowej szalce Petriego i sterylizuj naczynie promieniami UV przez 30 minut. Aby pobrać pęcherz, umieść mysz w pozycji leżącej na plecach i wysterylizuj okolice brzucha 70% etanolem.
Za pomocą kleszczy sterylizowanych etanolem i nożyczek chirurgicznych wykonaj początkowe jednocentymetrowe poprzeczne nacięcie skóry nad otworem cewki moczowej i rozszerz nacięcie po przekątnej w kierunku górnych kończyn myszy, aby utworzyć nacięcie w kształcie litery V wzdłuż całego przedniego odcinka myszy, które odsłania zawartość otrzewnej. Używając nowych wysterylizowanych narzędzi, delikatnie dociśnij poduszeczki tłuszczowe w pobliżu okolicy miednicy myszy, aby spowodować wysunięcie pęcherza i chwyć odsłonięty pęcherz na wierzchołku. Trzymając mocno pęcherz, przetnij moczowody i cewkę moczową, aby uwolnić pęcherz i włóż końcówkę jednego wałka zaokrąglonych kleszczy do otworu pęcherza, w którym właśnie został nacięty.
Zwolnij kleszcze, chwytając wierzchołek i utrzymując zaokrąglone kleszcze prawie całkowicie zamknięte, użyj drugiej pary kleszczy, aby delikatnie odciągnąć zewnętrzny koniec ust pęcherza moczowego od zaokrąglonych kleszczy i wokół i nad drugą końcówką zaokrąglonych kleszczy, aby obrócić pęcherz na lewą stronę. Następnie użyj drugiej pary kleszczy, aby delikatnie nakłonić odwrócony pęcherz z końcówki kleszczy do jednego mililitra zimnego PBS. I delikatnie zeskrob wewnętrzną warstwę komórek nabłonka na zewnątrz odwróconego pęcherza za pomocą dwóch par czystych kleszczy.
Gdy wszystkie komórki zostaną zeskrobane, włóż niewyciągnięty koniec ciągniętej szklanej kapilary do gumowej zatyczki rurki aspiratora i mocno dopasuj wąski koniec jednomililitrowej końcówki pipety do drugiego otwartego końca probówki. Ciasno dopasuj wąską końcówkę dwumililitrowej pipety zasysającej do otwartego, szerszego końca jednomililitrowej końcówki pipety i umieść zeskrobaną zawiesinę komórek pod mikroskopem preparacyjnym. Korzystając z powiększenia od 20 do 40x, zidentyfikuj IBC jako duże agregaty fluorescencyjne i zanurz cienki koniec szklanej kapilary w świeżej probówce PBS na jedną sekundę, aby zmniejszyć pobieranie niepożądanej objętości przez działanie kapilarne.
Po zlokalizowaniu interesującego IBC powoli przysuń otwarty koniec rurki kapilarnej w kierunku IBC i przyłóż bardzo małą siłę ssącą do pipety zasysającej, aby wprowadzić IBC do szklanej kapilary. Następnie przenieś kapilę do pustej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej i zastosuj lekkie nadciśnienie, aby usunąć kroplę i IBC do probówki. Oprócz potwierdzenia obecności pojedynczego izolowanego IBC w probówce zbiorczej za pomocą mikroskopu preparacyjnego, czystość wyizolowanego IBC można potwierdzić za pomocą mikroskopii konfokalnej.
Izolowane komórki powinny wybarwiać się zarówno na obecność E. coli, jak i uroprakiny i powinny mieć wielkość od 50 do 120 mikrometrów. Po wyizolowaniu obecność i żywotność komórek bakteryjnych w pojedynczym IBC można potwierdzić poprzez kwantyfikację jednostek tworzących kolonie lub ilościową reakcję łańcuchową polimerazy w celu uzyskania odpowiedników genomowych. Warto zauważyć, że niezakażone komórki nabłonkowe wyizolowane tym samym protokołem nie wykazują ilościowych ilości bakterii.
Co więcej, ilościowa analiza reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją potwierdza obecność genów bakteryjnych w szeregu indywidualnie izolowanych i połączonych IBC. Zawsze upewnij się, że mikropipeta do ust może łatwo pobierać i usuwać płyn. Nie wahaj się zmienić kapilary lub całego aparatu, jeśli mikropipeta do ust wydaje się niedrożna.
Ta technika mikropipetowania jamy ustnej pozwala nam bezpośrednio i specyficznie badać populacje wewnątrzkomórkowe, które tworzą się podczas eksperymentalnego ZUM. Bez tej techniki te populacje wewnątrzkomórkowe byłyby skażone bakteriami zewnątrzkomórkowymi i przewyższałyby je liczebnie. Niektóre inne czynniki zakaźne mogą być łatwiej rozpylane lub przenoszone niż E. coli, których użyliśmy w tej aplikacji.
W takich przypadkach uzasadnione mogą być pewne dodatkowe kontrole, takie jak dodanie filtra lub przedłużenie rurki, w zależności od używanego zastosowania. Pojemniki IBC wyizolowane przy użyciu tej techniki mikropipetowania jamy ustnej mogą być następnie wykorzystane w innych dalszych analizach pojedynczych komórek, takich jak sekwencjonowanie QRTPCR lub RNA.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę izolacji pojedynczych, zainfekowanych komórek nabłonka pęcherza moczowego z mysiego modelu zakażenia dróg moczowych (UTI). Technika ta umożliwia badanie wewnątrzkomórkowych społeczności bakteryjnych (IBCs) bez zanieczyszczeń bakteriami zewnątrzkomórkowymi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Choroby zakaźne
- Biologia komórki
Wprowadzenie
- Wewnątrzkomórkowe społeczności bakteryjne (IBCs) występują zarówno u myszy, jak i u pacjentów z ZUM.
- Technika mikropipetowania ustnego jest obecnie jedyną metodą izolacji IBCs z zainfekowanych pęcherzy moczowych myszy.
- Zrozumienie IBCs jest kluczowe dla badania patogenezy ZUM.
- Izolacja IBCs może ułatwić dalsze analizy, takie jak qPCR i sekwencjonowanie RNA.
Cel badania
- Izolacja pojedynczych IBC z mysich modeli ZUM.
- Umożliwienie szczegółowych badań populacji wewnątrzkomórkowych tworzonych podczas ZUM.
- Zapewnienie niezawodnej metody badania infekcji bakteryjnych na poziomie pojedynczych komórek.
Zastosowane metody
- Przygotowanie szklanych pipet wylotowych do izolacji komórek.
- Chirurgiczne wycięcie pęcherza moczowego od zakażonych myszy.
- Technika mikropipetowania w celu izolacji IBC z pęcherza moczowego.
- Potwierdzenie izolacji IBC przy użyciu mikroskopii i technik molekularnych.
Główne wyniki
- Pomyślną izolację IBC potwierdzono za pomocą mikroskopii.
- Izolowane komórki wykazały pozytywne barwienie na E. coli oraz uroplakinę.
- Analiza ilościowa potwierdziła obecność genów bakteryjnych w izolowanych IBC.
- W komórkach niezakażonych nie stwierdzono mierzalnej ilości bakterii, co potwierdza poprawność metody izolacji.
Wnioski
- Technika mikropipetowania ustnego jest skuteczna w izolowaniu IBC.
- Metoda ta pozwala na badanie wewnątrzkomórkowych populacji bakteryjnych bez ryzyka kontaminacji.
- Dalsze zastosowania mogą obejmować różnorodne analizy pojedynczych komórek w celu zrozumienia patogenezy ZUM.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Izolowanie pojedynczych wewnątrzkomórkowych społeczności bakteryjnych (IBCs) z mysich modeli zakażeń dróg moczowych umożliwia mechanistyczną weryfikację interakcji gospodarz-patogen z rozdzielczością komórkową. Podejście to wspiera walidację celów poprzez dostarczenie oczyszczonych, żywych zakażonych komórek nabłonkowych do późniejszych analiz pojedynczych komórek, co ogranicza sygnały zakłócające pochodzące od zewnątrzkomórkowych populacji bakterii. Opieranie się protokołu na powszechnie dostępnych materiałach oraz krótki czas izolacji (~8 godzin) zwiększa wykonalność wczesnych etapów prac nad odkrywaniem nowych celów przeciwdrobnoustrojowych oraz w badaniach fenotypowych w modelach zakażeń.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez izolację żywych IBC zawierających wewnątrzkomórkowe E. coli w celu oceny funkcjonalnej celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia system zminimalizowany pod kątem kontaminacji, pozwalający na wyjaśnienie mechanizmów przetrwania bakterii w komórkach gospodarza.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfelu badawczym poprzez generowanie mierzalnych danych o ekspresji genów bakteryjnych i żywotności z rozdzielczością do pojedynczej komórki.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na przygotowanie walidowanych systemów biologicznych (komórek nabłonkowych zawierających IBC) do ustandaryzowanych analiz następnych, takich jak qPCR lub sekwencjonowanie RNA.
- Wartość operacyjna: Zapewnia gotowość do analizy poprzez izolację pojedynczych komórek niemal wolnych od zanieczyszczeń, co poprawia powtarzalność w badaniach przesiewowych modeli infekcji.
- Skalowalność: Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy w różnych modelach infekcji, w których rzadkie zakażone komórki wymagają izolacji z mieszanin heterogenicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Zachowuje istotność w kontekście choroby poprzez izolację IBC z mysiego modelu ZUM, który odzwierciedla tworzenie się wewnątrzkomórkowych społeczności bakteryjnych u ludzi.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Ułatwia dopasowanie biomarkerów poprzez umożliwienie detekcji genów bakteryjnych (np. za pomocą qRT-PCR) w pojedynczo izolowanych IBC.
- Postęp dostosowany do ryzyka: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez potwierdzenie braku mierzalnych bakterii w niezakażonych kontrolach nabłonkowych, co waliduje specyficzność izolacji.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów badawczych, umożliwiając testowanie hipotez dotyczących wewnątrzkomórkowych szlaków przeżycia, przechodząc do identyfikacji wiodących związków poprzez analizę pojedynczych komórek wyizolowanych IBC oraz wspierając walidację przedkliniczną za pomocą profilowania ekspresji genów i żywotności.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych i ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez izolację IBC w celu badania wewnątrzkomórkowych populacji bakterii bez zanieczyszczeń pozakomórkowych.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy, powtarzalne wyniki z pojedynczych komórek, odpowiednie do oceny związków w modelach infekcji.
- Analityka: Generuje pomiary ilościowe (np. ekwiwalenty genomiczne za pomocą qPCR, liczenie CFU), które umożliwiają porównanie ładunku bakteryjnego i żywotności w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z ciągłością przedkliniczną poprzez izolację IBC istotnych dla choroby z mysiego modelu UTI.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Ustanawia możliwość wielokrotnego wykorzystania metody izolacji rzadkich zainfekowanych komórek z mieszanin, którą można zastosować poza UTI w innych modelach patogenów wewnątrzkomórkowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w badaniach nad interakcjami gospodarz-patogen.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność dzięki niskokosztowej, powszechnie dostępnej technice mikro-pipetowania.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną minimalizację ryzyka w odniesieniu do celów przeciwdrobnoustrojowych z wykorzystaniem fizjologicznie istotnych modeli zakażeń.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko, dostarczając danych o rozdzielczości pojedynczych komórek w zakresie wewnątrzkomórkowej persistencji bakterii i ekspresji genów.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w przeprowadzaniu zabiegów chirurgicznych u myszy, sterylnej obróbce tkanek oraz posługiwaniu się mikropipetą.
- Zależy od przygotowania kapilar szklanych, sterylizacji UV oraz infrastruktury mikroskopowej do sekcji.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia spójności izolacji IBC oraz późniejszych analiz molekularnych (np. qPCR, sekwencjonowanie RNA).
- Wiąże się z koniecznością dostosowania techniki przy zastosowaniu w innych modelach infekcji lub w przypadku typów komórek o różnej wielkości lub delikatności.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak ryzyko biologiczne związane z pipetowaniem ustnym, co wyklucza zastosowanie metody w przypadku czynników o wysokiej zakaźności.
