Eksperymenty dwuwarstwowe lipidowe z dwuwarstwami pęcherzyków kontaktowych dla zacisków krosowych
16 stycznia 2019
Tutaj prezentujemy protokół tworzenia dwuwarstw lipidowych za pomocą metody dwuwarstwowej pęcherzyków kontaktowych. Pęcherzyk wody jest wdmuchiwany do rozpuszczalnika organicznego, w wyniku czego na granicy faz woda-olej tworzy się monowarstwa. Dwie pipety są manipulowane w celu zadokowania pęcherzyków w celu utworzenia dwuwarstwy.
Metoda dwuwarstwowa pęcherzyków kontaktowych jest techniką alternatywną dla konwencjonalnych dwuwarstw lipidowych. Ta metoda pozwala na bardziej wszechstronne wibracje przez membranę. Metoda CBB łączy w sobie zalety planarnej dwuwarstwy lipidowej i metody zacisku krosowego.
Jako technikę dwuwarstwową lipidów można utworzyć CBB o dowolnym składzie lipidowym. Opracowaliśmy CBB do jednokanałowych nagrań prądowych o wysokim stosunku sygnału do szumu. Ta metoda pozwala na różnorodność drgań membrany i oferuje rozległą platformę typu do interfejsu membrany kanałowej.
Każdy doświadczył bańki mydlanej. Podobne manewry są wykonywane w przypadku tworzenia CBB poprzez ręczne dostrajanie przyłożonego ciśnienia, a nie ustami. Ćwicz i ciesz się CBB.
Aby wykonać tę procedurę, należy rozproszyć fosfolipidy w chloroformie w pożądanym stężeniu w kolbie okrągłodennej. Umieścić roztwór fosfolipidów na parowniku obrotowym podłączonym do butli z azotem gazowym. Obracać kolbę pod wpływem przepływu azotu w temperaturze pokojowej, aż pojawi się cienki film fosfolipidowy.
Następnie umieść otwartą kolbę w eksykatorze podłączonym do pompy próżniowej. Za pomocą pompy próżniowej zasysać wnętrze eksykatora przez kilka godzin, aby dokładnie usunąć chloroform. Następnie dodać odpowiednią objętość roztworu elektrolitu do kolby i zawiesić fosfolipid, aby uzyskać zawiesinę fosfolipidów w proporcjach dwóch miligramów na mililitr
.Utrwalaj zawiesinę przez 20 do 30 sekund za pomocą sonikatora do kąpieli, aby uzyskać wielowarstwową zawiesinę pęcherzykową. W celu przygotowania proteoliposomów zawierających białka kanałów jonowych należy dodać roztwór białka do wielowarstwowej zawiesiny pęcherzyków. I sonikować przez kilka sekund za pomocą soniku do kąpieli.
Aby przygotować szklane pipety o dużej średnicy, umieść szklaną kapilę w ściągaczu do pipet i wykonaj mikropipetę z cienką, stożkową końcówką w dwóch etapach. Następnie umieść mikropipetę na mikrokuźni i przyłóż końcówkę mikropipety do filamentu platynowego w zwężającej się części o średnicy od 30 do 50 mikrometrów. Podgrzej krótko filament i natychmiast go wyłącz
.Za pomocą wody destylowanej i etanolu oczyść powierzchnię szkiełka płytką studnią. Następnie nałóż odczynnik silikonowy na szkiełko podstawowe i pozwól odczynnikowi całkowicie wyschnąć na powietrzu. Następnie umieść szklane szkiełko na stoliku mikroskopu odwróconego.
Dodaj 100 mikrolitrów heksadekanu do płytkiej studzienki szkiełka silikonowanego. Za pomocą strzykawki tuberkulinowej napełnić roztwór elektrolitu do połowy długości mikropipety. Następnie umieść mikropipetę na uchwycie mikropipety z portem ciśnieniowym, pozwalając elektrodzie drucianej z srebrem/chlorkiem srebra zanurzyć się w roztworze elektrolitu pipety.
Podłącz jeden z uchwytów mikropipet do stopnia głowicy patch clamp amplifier, a drugi do uziemienia elektrycznego. Następnie podłącz mikrowtryskiwacz do portu ciśnieniowego uchwytu mikropipety. Ustawić mikropipetę w odpowiedniej pozycji nad stolikiem mikroskopu odwróconego za pomocą mikromanipulatora.
Aby wyregulować potencjał przesunięcia elektrody, umieść jeden mikrolitr tego samego roztworu elektrolitu, który jest używany do napełniania mikropipety, na płaskiej powierzchni wokół płytkiego dołka szklanego szkiełka, aby utworzyć kopułę elektrolitu. Zanurz końcówki obu mikropipet w kopule elektrolitu. Następnie wyreguluj potencjał przesunięcia elektrody wzmacniacza patch clamp.
Aby pobrać roztwór liposomu z końcówki, dodaj jeden mikrolitr roztworu liposomu na płaską powierzchnię wokół płytkiego dołka szkła szkiełkowego. Następnie umieść końcówkę mikropipety w kopule zawierającej liposom. Odessać roztwór zawierający liposom za pomocą mikroiniektora.
Powtórzyć procedurę dla drugiej mirkopipety dla liposomów odtworzonych w kanale aspiracyjnym. Teraz umieść mikropipetę w sześciokątu w płytkiej studzience. Powoli wydmuchuj bańkę wody, zwiększając ciśnienie, aż bańka osiągnie pożądany rozmiar, a następnie utrzymuj to samo ciśnienie.
Wyrzuć bańkę, przepuszczając końcówkę przez interfejs olej-powietrze, jeśli trudno jest utrzymać stabilny rozmiar pęcherzyka. Powtarzaj procedury, aż utworzą się dwie stabilne pęcherzyki. Nawiąż kontakt między dwoma bąbelkami.
Dostosuj ciśnienie, aby utrzymać rozmiar pęcherzyka, ponieważ rozmiar może się stopniowo zmieniać nawet przy stałym ciśnieniu wewnątrz pęcherzyka. Ustaw potencjał membrany na odpowiednią wartość za pomocą wzmacniacza typu patch claim amplifier i poczekaj, aż pojawi się prąd kanału. W celu stabilnego tworzenia dwuwarstw lipidowych konieczne jest oczyszczenie bibułek.
Preparat szklanej kapilary lub pipety należy dokładnie umyć i unikać zanieczyszczenia cząsteczkami detergentu. Po uformowaniu CBB cząsteczki kanału, albo w roztworze wodnym, albo w liposomie, zostały spontanicznie wprowadzone do dwuwarstwy w ciągu kilku do kilkudziesięciu minut. Indukcje kanałów potwierdzono stopniowym wzrostem amplitudy prądu pod wpływem przyłożonego potencjału membranowego.
Dwuwarstwa utworzona metodą CBB może zostać rozłożona na dwie monowarstwy. Prąd kanału pTB pojawił się natychmiast po podłączeniu dwóch monowarstw. Prąd stawał się większy wraz ze wzrostem styku, amplituda prądu była zsynchronizowana z manipulacją odłączania CBB.
Jeśli liczba wydmuchiwanych pęcherzyków wzrasta, stężenie lipidów w roztworze wodnym zmniejsza się i monowarstwa nie tworzy się. Następnie spróbuj zmniejszyć nacisk na sekcję liposomową. Po ustaleniu tworzenia CBB i rekonstytucji kanału można spróbować zmienić skład roztworu wodnego i membrany poprzez obfitowanie lub wstrzykiwanie substancji hydrofilowych lub hydrofobowych.
Metoda CBB otworzyła wszechstronne możliwości badania wzajemnych zależności między kanałem a membraną.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie wprowadza metodę dwuwarstwy bąbelkowej w kontakcie (Contact Bubble Bilayer – CBB) do tworzenia dwuwarstw lipidowych, stanowiącą innowacyjną alternatywę dla konwencjonalnych technik. Metoda ta umożliwia wszechstronne wibracje błon oraz rejestrację prądów pojedynczych kanałów z wysokim stosunkiem sygnału do szumu, co usprawnia badanie oddziaływań między kanałami a błoną.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biofizyka
- Elektrofizjologia
- Technologia membran lipidowych
Wprowadzenie
- Bilevelidowe warstwy lipidowe są kluczowe dla badania białek błonowych.
- Konwencjonalne metody wykazują ograniczenia w zakresie elastyczności i stabilności.
- Metoda CBB łączy zalety płaskich błon lipidowych oraz technik patch clamp.
- Technika ta umożliwia wysokiej jakości rejestrację aktywności kanałów jonowych.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody tworzenia lipidowych dwuwarstw z wykorzystaniem techniki bańki kontaktowej.
- Umożliwienie rejestracji pojedynczych kanałów przy poprawionej jakości sygnału.
- Badanie dynamiki błon oraz oddziaływań między kanałami a błonami.
Zastosowane metody
- Metoda CBB wykorzystuje kontrolowaną manipulację pęcherzykami powietrza w rozpuszczalniku organicznym w celu utworzenia dwuwarstw.
- Fosfolipidy są przygotowywane i poddawane sonikacji w celu utworzenia pęcherzyków wielowarstwowych, po czym następuje wbudowanie białek kanałów jonowych.
- Mikropipety są wytwarzane w celu precyzyjnego aplikowania i stabilizacji pęcherzyków podczas tworzenia dwuwarstw.
- Układy eksperymentalne obejmują wzmacniacze patch-clamp służące do monitorowania prądów kanałów jonowych po utworzeniu dwuwarstwy.
Główne wyniki
- Metoda CBB skutecznie wspomaga wbudowywanie białek kanałowych w biwarstwy, co zostało potwierdzone zmianami amplitudy prądu.
- Uformowano stabilne biwarstwy, co wykazało możliwość rejestracji prądów pojedynczych kanałów.
- Metoda wykazała, że regulacja wielkości pęcherzyka może wpływać na stabilność błony oraz ciągłość prądu.
Wnioski
- Metoda CBB stanowi znaczący postęp w tworzeniu lipidowych dwuwarstw, umożliwiając wszechstronne zastosowania w badaniach elektrofizjologicznych.
- To innowacyjne podejście pogłębia nasze zrozumienie dynamiki kanałów błonowych.
- Wyniki podkreślają potencjał adaptacji technologii lipidowych dwuwarstw do różnych warunków eksperymentalnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda dwuwarstwy pęcherzyka kontaktowego (CBB) rozwiązuje kluczowy problem w badaniach nad kanałami jonowymi, umożliwiając rejestrację sygnałów o wysokim stosunku sygnału do szumu przy jednoczesnej precyzyjnej kontroli nad składem lipidowym i mechaniką błony. Możliwość ta wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego w przypadku celów terapeutycznych poprzez wyjaśnienie oddziaływań między kanałem a błoną w warunkach istotnych fizjologicznie. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną na wczesnym etapie odkrywania leków, zapewniając powtarzalną platformę do walidacji funkcjonalnej celów w postaci kanałów jonowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju BioPharma
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez badanie funkcji kanałów jonowych w określonych środowiskach lipidowych.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez powtarzalne pomiary prądów pojedynczego kanału przy niskim poziomie szumów elektrycznych.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez wyjaśnienie, w jaki sposób skład lipidowy moduluje aktywność i stabilność kanałów.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy dwuwarstw lipidowych do dalszego przesiewania związków poprzez włączanie liposomów z rekonstytuowanymi kanałami.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację testu dzięki kontrolowanemu tworzeniu pęcherzyków i spójnej odnowie dwuwarstwy.
- Skalowalność: Wspiera ponowne wykorzystanie platformy poprzez powtarzalne cykle tworzenia i rozbijania CBB.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Zachowuje istotność badań od etapu odkrycia po prace przedkliniczne poprzez modelowanie składów lipidowych istotnych dla przebiegu choroby.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia ocenę wpływu zaburzeń błony na funkcję kanałów, co dostarcza informacji niezbędnych do przewidywania bezpieczeństwa i skuteczności.
- Zgodność z biomarkerami: Wspiera identyfikację zależnych od lipidów fenotypów kanałów, które mogą korelować z odpowiedziami klinicznymi.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda CBB wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, zapewniając platformę z możliwością kontroli lipidowej do charakteryzacji kanałów jonowych przed screeningiem związków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez umożliwienie kontrolowanej zmiany składu lipidów błonowych.
- Przesiewy: Zapewnia gotowość do przeprowadzania analiz dzięki powtarzalnemu tworzeniu dwuwarstw oraz stabilnej inkorporacji kanałów jonowych.
- Analityka: Dostarcza ilościowe odczyty prądów pojedynczego kanału, które pozwalają na porównanie zachowania kanałów w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy się z pracami przedklinicznymi poprzez umożliwienie badania oddziaływań kanał-błona w środowiskach lipidowych istotnych dla danej jednostki chorobowej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Funkcjonuje jako odnawialna możliwość, a nie technika jednorazowego użytku, wspierając ciągłe zastosowanie w wielu projektach.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w interakcjach między kanałem a błoną.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację dzięki kontrolowanemu utrzymaniu wielkości pęcherzyka i odnawianiu dwuwarstwy.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczenie wiarygodnych danych funkcjonalnych dotyczących celów w postaci kanałów jonowych na wczesnym etapie odkrywania.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację programów dotyczących kanałów jonowych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zwalidowaną aktywność zależną od błony.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pracy z lipidami, elektrofizjologii oraz manipulacji mikroprzepływowych.
- Zależność od wzmacniaczy patch-clamp, wyciągarek kapilar szklanych oraz mikroinjektorów do tworzenia pęcherzyków i kontroli ciśnienia.
- Konieczność standaryzacji przygotowania lipidów, kontroli wielkości pęcherzyków oraz protokołów czyszczenia w obrębie zespołów.
- Konieczność uwzględnienia modyfikacji przy zastosowaniu metody do różnych typów kanałów jonowych lub mieszanin lipidowych.
- Ograniczenia praktyczne, takie jak potrzeba skrupulatnego utrzymania wielkości pęcherzyków oraz unikania kontaminacji podczas przygotowania pipet.
