Metoda przebijania mikroelektrod w celu zarejestrowania potencjału błony z kaniulowanej tętnicy środkowej mózgu
2 lipca 2019
Głównym celem tego artykułu jest dostarczenie szczegółowych informacji na temat sposobu rejestrowania potencjału błonowego (Vm) z tętnicy środkowej mózgu za pomocą metody nabijania mikroelektrod. Kaniulowana tętnica środkowa mózgu jest równoważona w celu uzyskania tonu miogennego, a ściana naczynia jest przebijana za pomocą mikroelektrod o wysokiej rezystancji.
Protokół ten może być stosowany do pomiaru potencjału błonowego normalnych i chorych naczyń krwionośnych oraz do oceny środków farmakologicznych, które modulują potencjał błony, napięcie naczyniowe i przepływ krwi. Potencjały błonowe generowane przez tę technikę są bliskie zakresowi fizjologicznemu, ponieważ mięśnie gładkie naczyń krwionośnych w naczyniu znajdują się w syncytium. Przed rozpoczęciem procedury należy umieścić dwukanałowy wzmacniacz elektrometru różnicowego w pobliżu komory naczynia w żądanym miejscu.
Użyj BNC-BNC, aby podłączyć wyjście amplifier kanał A lub B do wejścia kanału digitizera. Zamontuj sondę w mikromanipulatorze i obróć mikromanipulator w kierunku mikroskopu i miografu na stole bez wibracji. Umieść pokrętła i przełączniki z przodu amplifier w odpowiednich pozycjach do eksperymentu, zgodnie z opisem w instrukcji.
Następnie podłącz uziemienie wanny do uziemienia obwodu amplifier za pomocą odpowiedniej elektrody i upewnij się, że klatka jest uziemiona do obudowy amplifier. Aby przygotować mikroelektrody ze szkła borokrzemianowego, użyj standardowego ściągacza, aby uzyskać krótki, stopniowy, ośmio- do 10-milimetrowy stożek o średnicy mniejszej niż jeden mikrometr, zapętlając się dwukrotnie w celu uzyskania wyższych oporów i mniejszych końcówek. Za pomocą strzykawki z mikrofibry napełnić mikroelektrodę trójmolowym chlorkiem potasu, powoli cofając tłok podczas wstrzykiwania, aby zrobić miejsce na wypełnienie płynu i zapobiec tworzeniu się pęcherzyków wewnątrz mikroelektrody.
Umieść w pełni załadowaną mikroelektrodę na uchwycie mikroelektrody i ostrożnie, ale stanowczo wepchnij trzpień elektrody do uchwytu przez wywiercony otwór. Usuń nadmiar płynu chusteczką laboratoryjną i podłącz zespół uchwytu elektrody do ampsonda lifier. Przeprowadź test elektrody, aby zmierzyć rezystancję elektrody.
Następnie otwórz oprogramowanie do nagrywania, przypisz nazwę do pliku i zapisz plik do przyszłej analizy. Następnie kilkakrotnie przepłucz komorę miografu wodą destylowaną przed załadowaniem jej pięcioma mililitrami normalnego roztworu soli fizjologicznej lub PSS. Za pomocą pięcio- lub 10-mililitrowej strzykawki napełnij zarówno szklane kaniule, jak i dołączoną rurkę przefiltrowanym normalnym PSS bez wprowadzania pęcherzyków powietrza i użyj kleszczyków, aby zrobić pół węzła w dwóch monofilamentowych nylonowych szwach 10-0.
Następnie, za pomocą kleszczy preparacyjnych pod mikroskopem preparacyjnym, umieść częściowo zamknięte węzły szwów na obu kaniulach nieco z dala od końcówek. W celu izolacji tętnicy środkowej mózgu użyj sprężynowych nożyczek i kleszczy, aby zidentyfikować i wypreparować nierozgałęziony odcinek środkowej tętnicy mózgowej o wewnętrznej średnicy od 100 do 200 mikrometrów mózgu szczura. Użyj cienkich kleszczyków, aby zamontować środkową tętnicę mózgową na szklanych kaniulach i zaciśnij szwy, aby przymocować tętnicę do kaniuli.
Zamknij dystalną kaniulę tak, aby nie było przepływu w tętnicy, a następnie podłącz pipetę dopływową do zbiornika PSS. Wizualizacja kaniulowanej tętnicy środkowej mózgu za pomocą kamery ze sprzężeniem ładunku zamontowanej na odwróconym mikroskopie i oprogramowaniu do obrazowania. Ustaw długość osiową MCA na przybliżoną długość, tak aby nie wydawała się ani sztywna, ani wiotka.
Zrównoważyć roztwór kąpieli z 95% tlenem i 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zanurz masę wzmacniacza w PSS miografu. Oświetl komorę naczynia i uwidocznij końcówkę mikroelektrody w roztworze kąpieli przez mikroskop.
Za pomocą mikromanipulatora przesuń końcówkę mikroelektrody blisko zewnętrznej ścianki naczynia krwionośnego i rozpocznij zapis. Powoli przesuwaj końcówkę mikroelektrody w kierunku naczynia, kierując się w stronę środka naczynia. Gdy końcówka znajdzie się w bliskiej odległości od naczynia, przesuń elektrodę do przodu jednym szybkim ruchem, aby przebić błonę mięśnia.
Po przeniknięciu przez membranę można zaobserwować zmiany w potencjale błony. Nie dotykaj mikromanipulatora po przebiciu membrany. Po zarejestrowaniu zmian potencjału membrany należy użyć manipulatora, aby jednym szybkim ruchem usunąć mikroelektrodę i zatrzymać zapis przed zapisaniem plików danych.
Przebijanie uważa się za udane, gdy następuje szybkie odchylenie do wartości ujemnych, potencjał membrany jest stabilny przez co najmniej 30 sekund, a napięcie gwałtownie powraca do zera miliwoltów po wyjęciu elektrody. Po udanym przebiciu i ustabilizowaniu potencjału błonowego, interesujące leki mogą być perfundowane do kąpieli i można zarejestrować zmiany w potencjale błonowym. W tym reprezentatywnym eksperfuzji z chlorkiem potasu zdepolaryzowała błonę o około sześć miliwoltów, podczas gdy perfuzja z zależnym od wapnia aktywatorem kanałów potasowych aktywowanych wapniem o dużej przewodności hiperpolaryzowała błonę o prawie cztery miliwolty.
Najważniejszą rzeczą do zapamiętania jest wyciąganie wysoce wytrzymałych mikroelektrod, które mają krótki, stopniowy stożek o średnicy mniejszej niż jeden mikrometr.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje protokół rejestracji potencjału błonowego (V m) z tętnicy środkowej mózgu z wykorzystaniem metody mikroelektrodowej impalacji. Technika ta umożliwia pomiar potencjałów błonowych zarówno w prawidłowych, jak i zmienionych chorobowo naczyniach krwionośnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Elektrofizjologia
- Biologia naczyniowa
- Farmakologia
Wstęp
- Tętnica środkowa mózgu ma kluczowe znaczenie dla przepływu krwi mózgowej.
- Zrozumienie potencjału błonowego jest niezbędne do oceny napięcia naczyniowego.
- Metoda ta umożliwia ocenę środków farmakologicznych wpływających na przepływ krwi.
- Potencjały błonowe są zbliżone do zakresów fizjologicznych dzięki syncytium mięśni gładkich naczyń.
Cel badania
- Aby przedstawić szczegółowy protokół pomiaru potencjału błonowego.
- Aby ocenić wpływ czynników farmakologicznych na napięcie naczyniowe.
- Aby zwiększyć zrozumienie regulacji przepływu krwi w stanach zdrowia i choroby.
Zastosowane metody
- Zastosowanie dwukanałowego różnicowego wzmacniacza elektrometru.
- Podłączenie wzmacniacza do dygityzera za pomocą kabla BNC-BNC.
- Montaż sondy w mikromanipulatorze w celu precyzyjnego pozycjonowania.
- Dostrojenie ustawień wzmacniacza zgodnie z instrukcją eksperymentalną.
Główne wyniki
- Pomyślny pomiar potencjału błonowego w środkowej tętnicy mózgowej.
- Wykazanie możliwości zastosowania tej techniki zarówno w naczyniach prawidłowych, jak i chorobowych.
- Walidacja fizjologicznego znaczenia zarejestrowanych potencjałów błonowych.
- Wnioski dotyczące modulacji napięcia naczyniowego przez środki farmakologiczne.
Wnioski
- Metoda impalacji mikroelektrodami jest skuteczna w badaniu fizjologii naczyniowej.
- Niniejszy protokół może pomóc w ocenie środków terapeutycznych ukierunkowanych na schorzenia naczyniowe.
- Dalsze badania mogą rozszerzyć wiedzę na temat znaczenia potencjału błonowego dla zdrowia naczyń.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dokładny pomiar potencjału błonowego mięśni gładkich naczyń umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w przypadku modulatorów kanałów jonowych w przedklinicznych programach sercowo-naczyniowych i naczyniowo-mózgowych. Metoda ta wspiera walidację celu poprzez powiązanie odczytów elektrofizjologicznych z regulacją napięcia naczyń i przepływu krwi, zapewniając pewność prognostyczną dla optymalizacji związków wiodących. Stanowi ona pomost między biologią odkrywczą a oceną translacyjną środków farmakologicznych wpływających na perfuzję mózgową.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na badanie hipotez terapeutycznych dotyczących funkcji kanałów jonowych i pomp elektrogennych w mięśniach gładkich naczyń krwionośnych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez korelację zmian potencjału błonowego z modulacją napięcia naczyniowego.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję portfolio poprzez identyfikację związków, które powodują depolaryzację lub hiperpolaryzację potencjału błonowego w tętnicach oporowych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane układy biologiczne (kaniulowaną tętnicę środkową mózgu) do przesiewu związków z zachowaniem stabilnych linii bazowych potencjału błonowego.
- Wynik ilościowy: Generuje powtarzalne pomiary potencjału błonowego w miliwoltach, umożliwiając analizę zależności dawka-odpowiedź dla czynników farmakologicznych.
- Powtarzalność przesiewu: Standaryzuje technikę wprowadzania elektrody do naczyń, aby zapewnić spójne odczyty elektrofizjologiczne dla walidacji trafień.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie chorobowe: Możliwość zastosowania w modelach chorych naczyń w celu oceny dysfunkcji kanałów jonowych w nadciśnieniu tętniczym, udarach lub zapaleniu naczyń.
- Ciągłość translacyjna: Powiązanie mechanizmu elektrofizjologicznego z efektami funkcjonalnymi, takimi jak regulacja mózgowego przepływu krwi.
- Decyzje w oparciu o analizę ryzyka: Dostarczanie informacji dla kryteriów go/no-go na podstawie zmian potencjału błonowego wywołanych przez badane związki.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkrywczego, od zaangażowania celu po walidację funkcjonalną w tętnicach oporowych, wspierając identyfikację związków wiodących oraz przedkliniczną ocenę skuteczności.
- Biologia odkrywcza: Testowanie hipotez mechanistycznych dotyczących udziału kanałów jonowych w potencjale spoczynkowym błony mięśni gładkich naczyń krwionośnych.
- Przesiewy: Uzyskanie gotowych do analizy preparatów ze stabilnymi pomiarami metodą mikroelektrod do przesiewania bibliotek związków.
- Analityka: Dostarczanie ilościowych odczytów potencjału błonowego (mV), które umożliwiają porównanie wpływu związków na pobudliwość naczyniową.
- Badania translacyjne: Powiązanie modulacji elektrofizjologicznej z następczymi analizami funkcjonalnymi napięcia naczyniowego i perfuzji.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanowienie wielokrotnego wykorzystania platformy elektrofizjologicznej dla wielu łożysk naczyniowych i modeli chorobowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w farmakologii naczyniowej poprzez bezpośredni pomiar elektrofizjologicznych skutków modulacji celu.
- Wartość operacyjna: Dostarcza zestandaryzowane, powtarzalne dane dotyczące potencjału błonowego w różnych laboratoriach i preparatach naczyniowych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) dzięki wczesnej identyfikacji pozatargetowych efektów elektrofizjologicznych na etapie odkrywania.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia dostosowany do ryzyka rozwój związków o korzystnych profilach bezpieczeństwa naczyniowego.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w przygotowywaniu mikroelektrod, sekcji naczyń oraz rejestracji elektrofizjologicznej.
- Zależny od niskoszumnych elektrometrów, digitalizatorów, mikromanipulatorów oraz zestawów obrazujących wolnych od wibracji.
- Wymaga standaryzacji kryteriów sukcesu wkłucia (np. stabilność przez 30 s, powrót do zera) dla wszystkich użytkowników.
- Adaptacja do innych tętnic oporowych (np. krezkowych, wieńcowych) może wymagać specyficznej dla danego naczynia kanulacji oraz wyrównania napięcia.
- Ograniczony przez techniczną skuteczność wkłucia oraz podatność na artefakty ruchowe podczas rejestracji.
