Analiza porównawcza zmian chorobowych za pomocą ukierunkowanego podejścia sekwencjonowania
5 listopada 2019
W artykule opisano metodę identyfikacji zmian klonalnych i subklonalnych wśród różnych próbek od danego pacjenta. Chociaż opisane tutaj eksperymenty koncentrują się na określonym typie nowotworu, podejście to ma szerokie zastosowanie do innych guzów litych.
Nasz protokół pozwala na uchwycenie genetycznego pokrewieństwa między zmianami pierwotnymi a przerzutowymi poprzez identyfikację zmian molekularnych zaangażowanych w postęp choroby. Nasza metoda daje możliwość zbadania pokrewieństwa genetycznego w próbce klinicznej z wysoką czułością i swoistością. Wynika to z integracji analizy molekularnej i histopatologicznej.
Ocena niejednorodności wewnątrznowotworowej w dziedzinie badań nad rakiem ma ogromne znaczenie w projektowaniu skutecznych strategii przeciwnowotworowych, a nasza metoda ma szerokie zastosowanie w wielu typach guzów litych. Po przygotowaniu i ilościowym określeniu interesujących bibliotek, rozcieńczyć każdą bibliotekę do stężenia 100 pikomolarów w wodzie wolnej od nukleaz i połączyć 10 mikrolitrów każdej rozcieńczonej biblioteki na pojedynczy przebieg w jednej probówce. Następnie wymieszaj biblioteki w puli przez pipetowanie.
Aby zainicjować sekwencjonowanie, najpierw otwórz przeglądarkę Torrent na komputerze podłączonym do systemu sekwencjonowania. Zaplanuj nowy przebieg, korzystając z ogólnego szablonu dla wybranej aplikacji, a następnie w zakładce zestawy wybierz system Ion Proton lub system Ion Gene Studio S5. Wybierz odpowiedni układ z menu rozwijanego typu układu i wybierz Ion AmpliSeq 2.0 Library Kit z listy rozwijanej zestawu bibliotek.
Wybierz przycisk Ion Chef dla zestawu szablonów i wybierz odpowiedni zestaw szefa kuchni z listy rozwijanej zestawu szablonów. Wybierz odpowiedni zestaw do sekwencjonowania z menu rozwijanego zestawu do sekwencjonowania i wybierz Ion Express z listy rozwijanej zestawu kodów kreskowych. Na karcie wtyczki wybierz wtyczkę do analizy pokrycia.
Na karcie planu wybierz GRCH37HG19 genom z listy rozwijanej biblioteki referencyjnej. Z listy rozwijanej regionów docelowych wybierz odpowiedni panel, który ma zostać sekwencjonowany. Następnie ustaw liczbę kodów kreskowych do sekwencjonowania i ustaw nazwę kodu kreskowego oraz nazwę próbki dla każdej biblioteki.
W przypadku rozcieńczenia bibliotek zbiorczych, rozcieńczyć bibliotekę podstawową wodą wolną od nukleaz do stężenia 25 pikomolarów dla chipa jonowo-protonowego i odpipetować 50 mikrolitrów każdej rozcieńczonej biblioteki na dno odpowiedniej probówki z próbką biblioteki. Załadować probówki z próbkami zawierające połączone rozcieńczone biblioteki do systemu przygotowania biblioteki i rozpocząć amplifikację klonalną. W przypadku sekwencjonowania nowej generacji postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby zainicjować instrument.
Po zakończeniu amplifikacji klonalnej otwórz drzwiczki instrumentu Ion Chef, a następnie otwórz pokrywę wirówki do ładowania chipów i wyjmij dwa chipy z systemu przygotowania biblioteki. Umieść wióry w oddzielnych pojemnikach do przechowywania wiórów i załaduj jeden z chipsów do komory na wióry w urządzeniu. Następnie zamknij pokrywę komory na wióry i rozpocznij sekwencjonowanie.
W przypadku analizy mutacji otwórz wtyczkę analizy pokrycia i użyj danych wyjściowych analizy pokrycia, aby zweryfikować głębokość pokrycia i jednorodność. Użyj wtyczki Torrent Variant Caller, aby wykonać wywołanie wariantu, wybierając odpowiednio linię zarodkową lub somatyczny przepływ pracy. Następnie pobierz przefiltrowane pliki formatu wywołania wariantów i użyj oprogramowania do przewidywania efektu wariantu w bazie danych NCBI RefSeq, aby dodać adnotacje do wariantów.
Aby oszacować różnice w liczbie kopii, użyj wtyczki do przesyłania jonów, aby załadować dane sekwencjonowania do oprogramowania do reportera jonów i skorzystaj z kompleksowego przepływu pracy normalnej pary guza w panelu raka do analizy danych. Ręcznie filtruj mutacje i warianty liczby kopii na podstawie wyników przypisanych przez oprogramowanie i weryfikuj je wizualnie za pomocą przeglądarki Integrative Genomics Viewer. Następnie wizualnie sprawdź wyrównanie pod kątem nietypowych odczytów, które mogą generować sztuczne wywołania, i sprawdź znormalizowane pokrycie dla wszystkich amplikonów w danym genie w porównaniu ze znormalizowanym pokryciem linii podstawowej, aby zweryfikować różnice w liczbie kopii.
Dla każdego przypadku należy zindeksować wywołania mutacji z sekwencjonowania normalnej tkanki lub krwi lub guza pierwotnego lub przerzutów. Oznacz jako linię zarodkową i odrzuć wywołania, które są również widoczne w danych sekwencjonowania DNA linii zarodkowej. Oznacz jako klonalne lub założycielskie mutacje, które są wspólne dla wszystkich zmian chorobowych danego pacjenta.
Następnie oznacz jako subklonalne lub progresoryjne mutacje, które zostały wykryte w niektórych, ale nie wszystkich zmianach u danego pacjenta. W tym reprezentatywnym eksperymencie sekwencjonowanie wielochorobowe pięciu przypadków litego raka pseudobrodawkowatego, ukierunkowane na sekwencje kodujące 409 genów związanych z rakiem, zidentyfikowało łącznie 27 mutacji somatycznych w ośmiu genach. Mutacje zdefiniowano jako założycielskie lub klonalne, gdy są wspólne dla wszystkich zmian u danego pacjenta i progresora lub subklonalne, gdy są wykrywane w niektórych, ale nie we wszystkich zmianach u danego pacjenta.
Konsekwentnie, barwienie immunohistochemiczne beta-kateniny i KMD6A było jednorodne wśród różnych zmian chorobowych w przypadkach z mutacjami odpowiednich genów. Umiarkowane barwienie KMD6A w zmutowanych próbkach sugeruje, że zmiana genetyczna prawdopodobnie zmieni funkcję, a nie ekspresję białka. Utrata funkcji KMD6A w guzach trzustki wiąże się z regulacją w górę markera niedotlenienia GLUT-1.
W związku z tym GLUT-1 uległ nadmiernej ekspresji w przypadkach z mutacjami KMD6A. Immunohistochemia BAP1 i TP53 potwierdziła, że mutacje w tych genach były subklonalne. W tym wirtualnym kariotypie reprezentatywnego przypadku pokazującego lokalizację, bliskość i status liczby kopii zmienionych genów, analiza zmienności liczby kopii przy użyciu danych sekwencjonowania ujawniła zmiany we wszystkich analizowanych próbkach.
W przeciwieństwie do mutacji punktowych, większość zmian zmienności liczby kopii była subklonalna. Walidacja i indeksacja mutacji i zmienności liczby kopii oraz porównanie normalnego DNA guza są ważne dla uniknięcia generowania fałszywych wywołań, które mogłyby unieważnić wyniki. Procedura ta może być również zastosowana do badań sekwencjonowania całego genomu, mających na celu zbadanie całego genomu w celu identyfikacji mutacji między zmianami różnych typów guzów litych.
W dziedzinie badań nad rakiem techniki te są kluczowymi narzędziami do zrozumienia biologii chorób o ważnych implikacjach klinicznych, mających na celu projektowanie spersonalizowanych i skutecznych terapii celowanych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół oceny heterogeniczności wewnątrzguza (ITH) poprzez integrację analizy histologicznej, wysokokryjącego sekwencjonowania wielu zmian oraz analiz immunofenotypowych. Metoda ta umożliwia identyfikację klonalnych i subklonalnych zmian genetycznych w zmianach pierwotnych i przerzutowych u tego samego pacjenta, co pozwala na zrozumienie ewolucji nowotworu i pomaga w projektowaniu skutecznych terapii celowanych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Genomika nowotworów
- Patologia molekularna
- Onkologia translacyjna
Wstęp
- ITH jest głównym czynnikiem wpływającym na sukces celowanych terapii nowotworowych.
- Sekwencjonowanie następnej generacji (NGS) ujawniło zmienność ITH w zależności od typu nowotworu.
- Zrozumienie relacji klonalnych między zmianami pierwotnymi a przerzutami jest kluczowe dla opracowania strategii terapeutycznej.
- Dokładne wykrywanie zdarzeń subklonalnych wymaga starannego przygotowania i analizy próbek.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnego protokołu do analizy porównawczej wielu zmian nowotworowych u tego samego pacjenta.
- Odróżnienie mutacji klonalnych (założycielskich) od subklonalnych (progresorów) oraz zmian liczby kopii.
- Integracja danych molekularnych i histopatologicznych w celu kompleksowej oceny ITH.
Zastosowane metody
- Staranne badanie patomorfologiczne i wzbogacanie próbki tkankowej w komórki nowotworowe.
- Przygotowanie i kwantyfikacja bibliotek DNA, a następnie ich rozcieńczenie i łączenie w celu sekwencjonowania.
- Sekwencjonowanie celowane o wysokim pokryciu 409 genów powiązanych z nowotworami przy użyciu systemów Ion Proton lub Ion Gene Studio S5.
- Analiza bioinformatyczna obejmująca wywoływanie wariantów, adnotację oraz ocenę wariacji liczby kopii.
- Immunohistochemia w celu oceny funkcjonalnych skutków specyficznych mutacji.
Główne wyniki
- Sekwencjonowanie wielu zmian pozwoliło zidentyfikować zarówno klonalne i subklonalne mutacje somatyczne, jak i wariacje liczby kopii.
- Mutacje klonalne były wspólne dla wszystkich zmian, podczas gdy mutacje subklonalne występowały tylko w niektórych z nich.
- Barwienie immunohistochemiczne potwierdziło funkcjonalny wpływ niektórych mutacji (np. KMD6A, BAP1, TP53).
- Wariacje liczby kopii były w przeważającej mierze subklonalne, co różniło się od rozkładu mutacji punktowych.
Wnioski
- Protokół umożliwia czułą i specyficzną ocenę heterogeniczności genetycznej w guzach litych.
- Integracja danych z sekwencjonowania i danych immunofenotypowych zapewnia kompleksowy wgląd w ewolucję nowotworu.
- Metodologia ta znajduje szerokie zastosowanie w różnych typach guzów litych i może stanowić podstawę dla strategii terapii spersonalizowanej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Porównawcza analiza zmian z wykorzystaniem sekwencjonowania celowanego bezpośrednio rozwiązuje problem heterogeniczności wewnątrznowotworowej, która stanowi kluczową barierę w opracowywaniu skutecznych terapii celowanych. Poprzez odróżnienie zmian klonalnych od subklonalnych w zmianach pierwotnych i przerzutowych, podejście to zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych i pozwala na podejmowanie decyzji portfelowych z uwzględnieniem ryzyka. Integracja danych molekularnych, histopatologicznych i immunofenotypowych umożliwia solidne ograniczanie ryzyka mechanistycznego w krytycznych punktach przełomowych fazy odkrycia i translacji.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjne mapowanie mutacji klonalnych i subklonalnych w celu wyjaśnienia hipotez terapeutycznych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez integrowanie dowodów genetycznych i immunofenotypowych.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez ujawnienie krajobrazu ewolucyjnego zmian nowotworowych.
- Zwiększa pewność prognostyczną przy wdrażaniu celów o spójnych zmianach klonalnych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane próbki pochodzące z zmian chorobowych do dalszych analiz molekularnych i funkcjonalnych.
- Standaryzuje przepływy pracy w zakresie sekwencjonowania i wyznaczania wariantów w celu uzyskania powtarzalnych wyników ilościowych.
- Umożliwia wiarygodne wykrywanie zmian somatycznych dla rzetelnej oceny związków w systemach istotnych dla danej choroby.
- Wspiera skalowalność i ponowne wykorzystanie platformy w odniesieniu do wielu typów nowotworów i badań.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie wyników genetycznych z biomarkerami immunofenotypowymi w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Pozwala na dostosowanie postępów do poziomu ryzyka poprzez odróżnienie mutacji sterujących (driver) od mutacji pasażerskich (passenger) w modelach przedklinicznych.
- Zapewnia strukturę do integrowania danych z wielu zmian chorobowych w strategiach projektowania spersonalizowanej terapii.
- Wspiera wybór odpowiedniego dla danej choroby układu w oparciu o architekturę klonalną i ekspresję biomarkerów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda sekwencjonowania celowanego integruje etapy od wczesnego odkrywania po badania translacyjne, wspierając identyfikację wiodących cząsteczek oraz walidację przedkliniczną w przypadkach, gdy heterogeniczność genetyczna stanowi kluczowy czynnik ryzyka.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez mapowanie klonalności mutacji w obrębie zmian chorobowych.
- Screening: Dostarcza powtarzalne, ilościowe dane dotyczące wariantów i liczby kopii w celu przygotowania testów.
- Analityka: Zapewnia wysokoczułe wykrywanie i adnotację zmian somatycznych do porównywania różnych stanów klinicznych.
- Badania translacyjne: Łączy dane genetyczne i immunofenotypowe z dopasowaniem biomarkerów i doborem modeli przedklinicznych.
- Zastosowania instytucjonalne: Oferuje ustandaryzowany, szeroko stosowalny schemat analizy wielu zmian w portfolio guzów litych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: zapewnia ustandaryzowane, skalowalne i powtarzalne przepływy pracy w zakresie sekwencjonowania i analizy.
- Wartość strategiczna: umożliwia podejmowanie świadomych decyzji go/no-go oraz efektywne zarządzanie portfelem kapitałowym poprzez wyjaśnienie architektury klonalnej.
- Wpływ na portfolio: wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój aktywów w oparciu o solidne dowody genetyczne.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu patologii molekularnej, sekwencjonowania nowej generacji oraz analizy bioinformatycznej.
- Wymaga dostępu do platform sekwencjonowania o wysokim pokryciu oraz zwalidowanego oprogramowania analitycznego.
- Konieczne jest rygorystyczne przetwarzanie próbek oraz wzbogacanie frakcji komórek nowotworowych w celu zminimalizowania artefaktów.
- Wskazana jest międzyzespołowa standaryzacja protokołów wywoływania wariantów (variant calling) oraz oceny immunofenotypowej.
- Metoda może być ograniczona przez zakres panelu genów docelowych oraz ograniczenia związane z jakością próbki.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:48
Library Pooling and Sequencing Run
2:28
Sample Library Dilution and Loading
3:00
Next Generation Sequencing
3:43
Mutation and Copy-Number Variation (CNV) Analysis
5:00
Somatic Mutation Indexing
5:36
Results: Representative Comparative Lesion Analyses
7:16
Conclusion
