Analiza zdolności uczenia się i zapamiętywania w mysim modelu choroby Alzheimera przy użyciu labiryntu wodnego Morrisa
29 października 2019
Tutaj opisany jest protokół do przeprowadzenia testów labiryntu wodnego Morrisa w celu oceny zdolności uczenia się i pamięci myszy modelowych z chorobą Alzheimera oraz oceny wpływu akupunktury manualnej na ich leczenie.
Eksperyment Morris Water Maze lub MWM stał się najczęściej stosowanym i klasycznym eksperymentem behawioralnym do oceny zdolności uczenia się przestrzennego i zapamiętywania zwierząt. Chociaż istnieje wiele artykułów na temat MWM, w praktyce badacze nadal czują się zdezorientowani. Dlatego ten intuicyjny i rygorystyczny film z procesu obsługi jest szczególnie ważny.
Wcześniej przeprowadziliśmy badanie oparte na MWM, które sugerowało, że akupunktura może złagodzić objawy myszy modelowych AD. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół operacyjny MWM stosowany w naszych ostatnich badaniach, aby zapewnić badaczom prostą i widoczną metodę oceny uczenia się przestrzennego i pamięci zwierząt modelowych AD. MWM jest potężną techniką oceny funkcji poznawczych i jest szeroko stosowana w badaniach.
Nie ma jednak zdefiniowanych ani standardowych parametrów do wykonania zadania, takich jak rozmiar puli i platformy. Tak więc prawdziwa demonstracja metody ma kluczowe znaczenie. Zacznij od przygotowania się do testu Morris Water Maze lub MWM zgodnie ze wskazówkami rękopisu.
Urządzenie MWM oraz system akwizycji i przetwarzania sygnałów powinny znajdować się w pomieszczeniu doświadczalnym przeznaczonym do utrzymania izolacji akustycznej. Okrągły biały zbiornik otoczony nieprzezroczystą tkaniną powinien być umieszczony na środku urządzenia MWM. Kamera wideo powinna być przymocowana do sufitu urządzenia i podłączona do magnetowidu z automatycznym systemem śledzenia.
Podziel zbiornik labiryntu wodnego na cztery równe regiony za pomocą linii oznaczonych północą, południem, wschodem i zachodem, które koncepcyjnie podzielą obszar basenu na cztery ćwiartki. Następnie umieść unikalną wskazówkę wizualną na ścianie każdego kwadrantu w zasięgu wzroku myszy. Napełnij okrągły zbiornik wodą na głębokość 30 centymetrów i dodaj do wody 150 gramów mleka w proszku, aby był nieprzezroczysty.
Aby przeprowadzić próbę Visible Platform, umieść plastikową okrągłą platformę jeden centymetr nad powierzchnią wody w dowolnym kwadrancie losowo i umieść na niej czarną flagę. Delikatnie wpuść każdą mysz do wody z jednego z czterech miejsc startowych skierowanych w stronę ściany zbiornika. Aktywuj komputerowy program śledzący, gdy tylko mysz zostanie wypuszczona do wody i daj każdej myszy 60 sekund na dotarcie do platformy.
Pod koniec każdej próby umieść mysz na platformie i pozwól jej pozostać tam przez 10 do 30 sekund. Obserwuj trajektorie pływania myszy na komputerze. Zapisz czas, w którym mysz znalazła platformę, jako opóźnienie ucieczki i przeanalizuj prędkość pływania myszy.
Następnie osusz mysz ręcznikami i ogrzej ją grzejnikiem elektrycznym. Przesuń platformę i wykonaj cztery próby na mysz, uruchamiając mysz w innym kwadrancie. Pozwól myszy na regenerację przez 15 do 20 minut między każdą próbą.
Aby przeprowadzić próbę ukrytej platformy, umieść tę samą platformę bez flagi w południowo-wschodnim kwadrancie. Następnie umieść mysz losowo w jednym z czterech kwadrantów i daj jej 60 sekund na znalezienie ukrytej platformy. Jeśli mysz nie może znaleźć platformy w ciągu 60 sekund, poprowadź ją do platformy i pozwól jej pozostać tam przez 10 do 30 sekund.
Rejestruj opóźnienie ucieczki każdej próby. Osusz mysz ręcznikami i utrzymuj ją w cieple za pomocą grzejnika elektrycznego. Wykonaj cztery próby na mysz z 15 do 20 minutami między każdą próbą, uruchamiając mysz za każdym razem w innym kwadrancie.
Powtarzaj próby przez pięć kolejnych dni z platformą i wskazówkami wizualnymi w stałych pozycjach. Aby przeprowadzić próbę sondy, zdejmij platformę i umieść mysz w wodzie skierowanej w stronę ściany zbiornika w północno-zachodnim kwadrancie. Zapisz jego dystans pływania, prędkość i numer skrzyżowania platformy.
Po zakończeniu osusz mysz i utrzymuj ją w cieple. Aby przeprowadzić próbę odwróconą, umieść platformę w północno-zachodnim kwadrancie i powtórz próbę ukrytej platformy. Protokół ten został wykorzystany do zbadania wpływu akupunktury manualnej lub MA na uczenie się i pamięć myszy z chorobą Alzheimera.
W grupie z MA, leczenie rozpoczęło się 15 dni przed badaniem MWM i trwało przez 11 dni testów. Podczas testu Visible Platform w pierwszym dniu MWM nie zaobserwowano żadnych różnic statystycznych w opóźnieniu ucieczki czy prędkości pływania między grupami. Podczas badania Hidden Platform i Reversal opóźnienie ucieczki w grupie z chorobą Alzheimera lub AD pozostało wysokie, podczas gdy opóźnienie w pozostałych trzech grupach stopniowo się zmniejszało.
Co ważne, opóźnienie ucieczki w grupie MA było krótsze niż w grupie AD. Podczas badania Probe liczba myszy w grupie MA była niższa niż w grupie kontrolnej, ale znacznie wyższa niż w grupie AD. Co więcej, procent czasu, jaki myszy MA spędziły w kwadrancie, w którym wcześniej znajdowała się platforma, był podobny do grupy lekowej, która była mniejsza niż kontrolna, ale większa niż AD.It ważne jest, aby pamiętać, że jeśli mysz nie może znaleźć platformy w ciągu 60 sekund, badacz powinien skierować ją na platformę i pozwolić jej pozostać tam przez 10 do 30 sekund.
Nie ma konkretnych norm dotyczących wymiarów basenu i wielkości platformy. Parametry te muszą być zoptymalizowane we wstępnych doświadczeniach zgodnie z wymaganiami doświadczalnymi i kondycją zwierząt doświadczalnych. Większość badań należy przeprowadzić na podstawowych eksperymentach, takich jak MWM.
Obecnie elastyczność MWM jako narzędzia eksperymentalnego polega jedynie na możliwości wyboru podstawowych protokołów zgodnie z proponowanym badaniem, a zatem test ten może być stosowany do bardziej dogłębnej oceny funkcji poznawczych.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół przeprowadzania testów w labiryncie wodnym Morrisa (MWM) w celu oceny uczenia się i pamięci u myszy będących modelem choroby Alzheimera. Ocenia on również efekty zastosowania akupunktury manualnej jako metody leczenia tych myszy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Analiza behawioralna
- Badania nad chorobą Alzheimera
Wstęp
- Labirynt wodny Morrisa jest powszechnie stosowanym eksperymentem behawioralnym służącym do oceny uczenia się przestrzennego i pamięci u zwierząt.
- Mimo swojej popularności, badacze często napotykają trudności podczas realizacji protokołu MWM.
- Akupunktura została zasugerowana jako potencjalna metoda leczenia łagodząca objawy u myszy w modelu choroby Alzheimera.
- Standardowe parametry wykonywania MWM nie są jasno zdefiniowane, co sprawia, że niezbędne są precyzyjne wytyczne operacyjne.
Cel badania
- Aby przedstawić przejrzysty protokół testu MWM.
- Aby ocenić funkcje poznawcze u myszy będących modelami choroby Alzheimera.
- Aby zbadać wpływ akupunktury manualnej na uczenie się i pamięć u tych myszy.
Zastosowane metody
- Przygotowanie wodnego labiryntu Morrisa o określonych wymiarach i z odpowiednimi wskazówkami wizualnymi.
- Przeprowadzenie prób z platformą widoczną i ukrytą w celu zmierzenia latencji ucieczki oraz prędkości pływania.
- Wykonanie prób sondujących (Probe) i odwróconych (Reverse) w celu oceny retencji pamięci i elastyczności poznawczej.
- Analiza wpływu ręcznej akupunktury na wyniki myszy w wodnym labiryncie Morrisa.
Główne wyniki
- W teście z widoczną platformą (Visible Platform) nie zaobserwowano istotnych różnic w czasie dotarcia do celu (escape latency) pomiędzy grupami.
- Grupa MA wykazała krótszy czas dotarcia do celu w porównaniu z grupą AD podczas prób z ukrytą platformą (Hidden Platform) oraz prób odwrócenia (Reversal).
- W próbie sondującej (Probe trial) grupa MA wykazała większą liczbę przecięć obszaru platformy niż grupa AD.
- Myszy z grupy MA spędziły podobny procent czasu w kwadrancie docelowym co grupa przyjmująca lek, co wskazuje na poprawę retencji pamięci.
Wnioski
- MWM jest skutecznym narzędziem do oceny funkcji poznawczych u myszy w modelu choroby Alzheimera.
- Akupunktura manualna może poprawić procesy uczenia się i pamięci u tych myszy.
- Konieczne są dalsze badania w celu optymalizacji parametrów MWM dla różnych warunków eksperymentalnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Labirynt wodny Morrisa (MWM) stanowi ustandaryzowany test behawioralny służący do oceny uczenia się przestrzennego i pamięci w przedklinicznych modelach choroby Alzheimera, co wspiera walidację celów terapeutycznych oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego. Poprzez kwantyfikację czasu dotarcia do platformy (escape latency), liczby przejść nad platformą oraz preferencji kwadrantu, MWM umożliwia obiektywną ocenę fenotypów poznawczych i efektów interwencji terapeutycznych. Test ten zwiększa pewność prognostyczną we wczesnych etapach odkrywania leków, wiążąc wyniki behawioralne z układami istotnymi dla przebiegu choroby i ułatwiając podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań w procesach badawczo-rozwojowych o charakterze translacyjnym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez pomiar deficytów poznawczych u myszy w modelu choroby Alzheimera.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celów terapeutycznych poprzez ilościową ocenę zdolności uczenia się i pamięci.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów z portfolio poprzez identyfikację związków, które poprawiają czas ucieczki oraz retencję pamięci w systemach istotnych dla danej choroby.
Przesiewanie i rozwój testów
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszego przesiewania związków z wykorzystaniem zestandaryzowanych protokołów MWM.
- Powtarzalność: Zapewnia spójne wyniki ilościowe w poszczególnych próbach dzięki zdefiniowanym pomiarom czasu ucieczki oraz prędkości pływania.
- Skalowalność przesiewania: Wspiera ponowne wykorzystanie platformy i współpracę międzyfunkcyjną poprzez zestandaryzowane struktury prób oraz systemy wskazówek wizualnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Modeluje postępującą utratę pamięci charakterystyczną dla choroby Alzheimera poprzez deficyty uczenia się przestrzennego.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez ocenę funkcjonalnych wyników poznawczych.
- Postęp skorygowany o ryzyko: Wspiera proces podejmowania decyzji poprzez pomiar uczenia się odwróconego oraz wyników prób sondujących jako wskaźników elastyczności poznawczej i retencji pamięci.
Integracja potoku i przepływu pracy
MWM integruje się z kontinuum odkrywania leków, od walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po przedkliniczne badania skuteczności, zapewniając fenotypowanie behawioralne na każdym z tych etapów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez kwantyfikację deficytów uczenia się przestrzennego i pamięci w modelach choroby Alzheimera.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość testową i powtarzalne wyniki ilościowe dzięki standaryzowanym próbom z platformą widoczną i ukrytą.
- Analityka: Generuje pomiary latencji ucieczki, prędkości pływania, liczby przekroczeń platformy oraz preferencji kwadrantu, co umożliwia porównawczą analizę warunków.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez ocenę retencji pamięci i odwracania deficytów poznawczych jako translacyjnych biomarkerów skuteczności terapeutycznej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Funkcjonuje jako wielokrotnego użytku platforma do fenotypowania behawioralnego w wielu obszarach terapeutycznych i klasach celów molekularnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez ograniczenie niejednoznaczności mechanistycznej w ocenach funkcji poznawczych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację, powtarzalność i skalowalność dzięki zdefiniowanym protokołom badań oraz zautomatyzowanym systemom śledzenia.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje dotyczące kontynuacji lub przerwania badań (go/no-go), zwiększa efektywność kapitałową i redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach dzięki obiektywnemu fenotypowaniu poznawczemu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju w oparciu o mierzalną poprawę wydajności uczenia się i pamięci.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy z zakresu neuronauki behawioralnej oraz systemów zautomatyzowanego śledzenia wideo w celu dokładnego gromadzenia danych.
- Wymaga oprzyrządowania, w tym kolistego labiryntu wodnego, kamery nadzorczej, rejestratora wideo oraz systemu kontroli temperatury w celu zapewnienia dobrostanu zwierząt.
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji wymiarów basenu, wskazówek wizualnych oraz czasu trwania prób, aby zapewnić powtarzalność wyników w różnych ośrodkach.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji podczas przenoszenia protokołów na różne szczepy gryzoni, grupy wiekowe i modele chorób.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak zmienność strategii pływania i reakcji stresowych, które muszą być kontrolowane poprzez zestandaryzowane procedury obchodzenia się ze zwierzętami i aklimatyzacji.
