Obrazowanie 3D próbek tkanek miękkich przy użyciu metody barwienia specyficznego dla promieniowania rentgenowskiego i nanoskopowej tomografii komputerowej

Nasz nowy protokół pozwala nam na wizualizację struktur komórkowych w 3D za pomocą rentgenowskiej tomografii komputerowej. Robimy to poprzez barwienie tkanek eozyną i w ten sposób uwidacznia się cytoplazma. Oprócz zastosowań i badań medycznych, uważamy również, że nasza metoda może być stosowana w biologii, takiej jak na przykład badania zoologiczne lub biologia rozwojowa.

Technika jest stosunkowo prosta, bardzo szybka i nadaje się również do większych próbek tkanek. Uważamy, że nasze podejście w połączeniu z rentgenowską mikrotomografią komputerową można zintegrować z przepływem pracy klinicznej, a następnie faktycznie pomóc patologom w podejmowaniu lepszych decyzji. Zacznij od utrwalenia próbek tkanek miękkich.

Napełnij 50-mililitrową probówkę wirówkową roztworem utrwalającym zawierającym 9,5 mililitra 4% formaldehydu i 0,5 mililitra lodowatego kwasu octowego. Dodaj próbkę tkanek miękkich do probówki wirówkowej i wstaw do lodówki na 24 do 72 godzin. Po schłodzeniu przemyć próbkę tkanek miękkich roztworem DPBS przez jedną godzinę.

Następnie wybarwić próbkę, umieszczając ją w dwóch mililitrach roztworu barwiącego Eozyna Y i inkubować na poziomej płytce wstrząsającej przez 24 godziny. Następnego dnia ostrożnie wyjmij próbkę tkanek miękkich z pojemnika na próbkę i usuń nadmiar środka barwiącego bibułą celulozową. Umieść go w stożkowym pojemniku nad fazą parową etanolu do przechowywania i dalszego wykorzystania.

Przygotuj odpowiedni uchwyt na próbkę do zamontowania próbki tkanek miękkich zgodnie ze wskazówkami rękopisu i upewnij się, że jest ściśle dopasowany, aby zapobiec przesuwaniu się próbki podczas pomiarów rentgenowskich TK. Gdy klej stwardnieje, a uchwyt na próbkę będzie gotowy do użycia, przenieś nerkę myszy do nienaruszonej probówki wirówkowej, która zawiera kilka kropli 70% etanolu na dnie. Umieść zamontowaną próbkę w tomografie rentgenowskim.

Po dokładnym wyrównaniu próbki wybierz parametry akwizycji, aby uzyskać najlepszą jakość obrazu. W przypadku prezentowanych danych z mikrotomografii komputerowej należy wykonać skan przy napięciu szczytowym 50 kilowoltów i prądzie o mocy 3,5 wata, korzystając z 1601 projekcji równomiernie rozłożonych w zakresie 360 stopni. Następnie użyj danych mikro CT ze skanu przeglądowego, aby wybrać obszar zainteresowania dla skanu CT o wysokiej rozdzielczości.

Przygotuj interesujące objętości próbki tkanek miękkich, tnąc ją na bardzo małe kawałki o długości krawędzi około 0,5 milimetra za pomocą skalpela i mikroskopu stereoskopowego. Jeśli używasz nerki myszy, pokrój ją na dwie połówki wzdłuż najdłuższej osi. Weź połowę i przygotuj różne obszary anatomiczne, takie jak kora nerkowa i rdzeń nerki.

Przenieś małe kawałki na nową szalkę Petriego w celu odwodnienia. Odwodnić próbki za pomocą szeregu roztworów etanolu zgodnie ze wskazówkami zawartymi w manuskrypcie, wykonując każdy etap odwadniania przez jedną godzinę. Przenieś odwodnione próbki do mikroporowatej kapsułki i zamknij ją.

Próbki należy zawsze utrzymywać w kontakcie ze 100% etanolem. Następnie w krytycznym punkcie wysuszyć małe kawałki tkanki. Po przygotowaniu próbek tkanek należy je przechowywać na nowej szalce Petriego przechowywanej w eksykatorze przed dalszym użyciem.

Zamontuj kawałki tkanki w odpowiednim uchwycie na próbkę, zapewniając ścisłe dopasowanie. W przypadku nerki myszy przyklej kawałki do uchwytu na próbkę za pomocą mikroskopu stereoskopowego. Po dokładnym wyrównaniu próbki należy wybrać parametry akwizycji, aby uzyskać najlepszą jakość obrazowania.

Dla prezentowanych danych nano-CT uzyskaj projekcje przy szczytowym napięciu 60 kilowoltów z 1599 projekcjami równomiernie rozłożonymi w 360 stopniach i rozmiarem woksela około 400 nanometrów. Protokół ten został wykorzystany do wizualizacji 3D mikroskopijnych struktur tkankowych nerki myszy. Pomiary mikrotomografii komputerowej o niskiej rozdzielczości pozwoliły na przegląd całego narządu i pomogły zidentyfikować objętości zainteresowania dla pomiarów o wysokiej rozdzielczości.

Ta sama nerka myszy została wykorzystana do uzyskania danych z mikrotomografii komputerowej o wysokiej rozdzielczości. Uzyskuje się bardziej szczegółowy widok struktur anatomicznych, takich jak między innymi kora, rdzeń zewnętrzny i rdzeń wewnętrzny. Interesujący obraz przedstawia obszar rdzenia i wirtualny przekrój przez naczynie.

Nano-CT wykorzystano do uzyskania szczegółowego obrazu próbki nerki na poziomie komórkowym. Mały fragment tkanki uzyskany z całej nerki myszy został wykorzystany do zobrazowania grubych wznoszących się kończyn pętli Henlego o rozmiarze woksela około 400 nanometrów. Przeprowadzono badanie porównawcze, aby upewnić się, że nano-CT jest w pełni kompatybilny z histopatologią.

Podejście oparte na obrazowaniu multimodalnym potwierdziło wyniki uzyskane obiema metodami. Na etapie inkubacji ważne jest, aby próbka była całkowicie otoczona roztworem barwiącym. Również podczas wykonywania obrazowania rentgenowskiego TK najważniejszym faktem jest zapewnienie stabilności próbki podczas pozyskiwania danych.

Próbki tkanek miękkich, które zostały przeanalizowane za pomocą naszego protokołu, mogą być dalej analizowane przy użyciu standardowych technik histologicznych, takich jak barwienie przeciwstawne hematoksyliny. Nasz protokół barwienia znacząco przyczyni się do postępu w histologii rentgenowskiej 3D. Badania medyczne szczególnie skorzystają z tej nieniszczącej techniki obrazowania 3D.