Ekspresja, oczyszczanie i wiązanie liposomów pączkujących heterodimerów SNX-BAR drożdży

SNX-BAR to białka przebudowujące błonę, które odgrywają kluczową rolę w chorobach człowieka. Korzystając z naszych metod, możemy określić ich dokładne właściwości biofizyczne, aby ułatwić wiązanie lipidów i przebudowę błon. Oczyszczanie białek SNB-BAR z komórek drożdży pozwala na pozyskanie natywnych dimerów homo i hetero SNX-BAR przy jednoczesnym zminimalizowaniu toksyczności i nierozpuszczalności często spotykanych w przypadku nienatywnych systemów ekspresji.

Nasze metody mogą być wykorzystane do zrozumienia swoistości lipidowej wszystkich drożdży SNX-BAR lub do produkcji rekombinowanych białek SNX-BAR z dowolnego innego organizmu. Prawidłowy montaż ekstrudera jest niezbędny, aby zapobiec utracie liposomów podczas procesu wytłaczania. W przypadku początkujących uczniów lub tych, którzy są nowicjuszami w tej dziedzinie, wizualne obserwowanie najważniejszych kroków znacznie zwiększy Twoje szanse na sukces.

Zacznij od zaszczepienia dużego wymazu komórek drożdży do kolby o objętości co najmniej czterokrotnie większej niż objętość kultury zawierającej 50 mililitrów standardowej pożywki YP uzupełnionej 2% rafinozą i 0,1% glukozy jako źródłem węgla i hoduj kulturę przez noc w wytrząsarce o temperaturze 30 stopni Celsjusza. Następnego ranka zaszczepij 50-mililitrową kulturę wstępną w jednym litrze standardowej pożywki YP z 2% rafinozą i 0,1% glukozy w kolbie Fernbacha o objętości 2,8 litra na czterogodzinną hodowlę w inkubatorze z wytrząsaniem. Gdy gęstość optyczna przy 600 nanometrach osiągnie 0,2, dodaj galaktozę do końcowego stężenia 2% do komórek w celu hodowli przez noc w inkubatorze z wytrząsaniem.

Następnego ranka zbierz komórki przez odwirowanie i przenieś granulki drożdży do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Ponownie zawiesić osad w 15 mililitrach buforu oczyszczającego, aby uzyskać końcową objętość około 30 mililitrów i załadować zawiesinę komórek do homogenizatora schłodzonego do czterech stopni Celsjusza. Lizuj próbki w temperaturze od 20 do 25 000 funtów na cal kwadratowy przez dwie do trzech rund i przenieś lizat do nowej 50-mililitrowej stożkowej rurki na lodzie.

Natychmiast usunąć lizat komórkowy przez odwirowanie i ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki. Następnie zrównoważyć 300 mikrolitrów kulek IgG Sepharose z trzema re-zawiesinami w buforze oczyszczającym przed dodaniem kulek do oczyszczonego lizatu komórkowego na dwugodzinną inkubację z obracaniem w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji dodać kulki do 10-mililitrowej kolumny chromatograficznej i pozwolić niezwiązanemu lizatowi przepłynąć.

Umyj koraliki 10 razy jednym mililitrem buforu do prania na pranie, pozwalając, aby każde pranie całkowicie przepłynęło przed dodaniem następnej objętości. Po ostatnim umyciu za pomocą pipety i świeżego bufora przenieś kulki do probówki mikrowirówkowej. Doprowadzić całkowitą objętość kulek do 500 mikrolitrów za pomocą świeżego buforu do płukania i usunąć kulki z lizatu za pomocą dwóch mikrolitrów proteazy TEV po 10 miligramów na mililitr TEV do inkubacji przez noc z rotacją w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnego ranka użyj igły o rozmiarze 27, aby całkowicie usunąć supernatant i ocenić czystość białka za pomocą 10% strony SDS poliakrylamidu. Następnie oznacz ilościowo skoncentrowane białka za pomocą testu białkowego Bradforda zgodnie ze standardowymi protokołami i przechowuj białko przez okres do jednego tygodnia w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby przygotować liposomy, użyj szklanych strzykawek, aby przenieść podstawowe lipidy do czystej szklanej probówki hodowlanej, aby uzyskać końcową mieszaninę lipidów 1% fosfatydyloinozytolu-3-fosforanu, 20% ergosterolu, 30% fosfatydyloseryny, fosfatydylocholiny, jak opisano w tabeli.

W zależności od rozpuszczalników, w których każdy lipid jest ponownie zawieszony, mieszanina może stać się mętna po dodaniu każdego lipidu. Ostrożnie wysuszyć mieszaniny lipidów, kierując gazowy azot o niskim przepływie na mieszaniny ruchem okrężnym, aby równomiernie potraktować lipidy na dnie szklanej probówki. Następnie owiń szklaną probówkę hodowlaną folią, pozostawiając otwór odkryty i dalej odwadniaj lipidy w próżni przez godzinę.

Pod koniec inkubacji dodaj 400 mikrolitrów buforu wiążącego do każdej fiolki, aby całkowicie nawodnić lipidy przy końcowym stężeniu liposomów 2,5 milimola, a następnie ponownie zawiesić lipidy ze średnią prędkością w wirze w temperaturze pokojowej na 30 minut. Bufor powinien stać się mętny w miarę ponownego zawieszania lipidów. Przenieś zawieszone liposomy do probówki mikrowirówkowej i zamroź probówki w ciekłym azocie, a następnie rozmroź w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza siedem do ośmiu razy.

W dygestoriastycznym dygestoriociągu chemicznym wyczyść dwie jednomililitrowe szklane strzykawki pełną objętością chloroformu trzy razy na strzykawkę, aby usunąć wszelkie pozostałości lipidów i zrównoważyć każdą strzykawkę dwiema objętościami ultraczystej wody i dwiema objętościami buforu wiążącego. Zmontuj mini-ekstruder zgodnie z zaleceniami producenta. Następnie zanurz dwa kawałki wspornika filtra w jednej membranie o długości 200 nanometrów w buforze wiążącym.

Ważne jest, aby zmontować mini-ekstruder tak, aby był całkowicie szczelny. Dobrym sposobem sprawdzenia, czy nie ma wycieków, jest przepuszczenie bufora przez urządzenie. Umieść membranę między wspornikami filtra i umieść membranę w mini-ekstruderze.

Za pomocą jednej ze zrównoważonych strzykawek o pojemności jednego mililitra przepuść objętość buforu wiążącego podobną do objętości mieszaniny liposomów przez mini-wytłaczarkę i użyj drugiej strzykawki, aby upuścić mieszaninę liposomów, odwracając probówkę mikrowirówki, aby zebrać ostatnie liposomy do nasadki probówki w celu ich zebrania. Następnie wytłaczaj liposomy przez membranę 200 nanometrów od 19 do 21 razy i zbierz wytłaczane liposomy do nowej probówki do mikrowirówki. Przed wykonaniem testów wiązania liposomów i kanalików SNX-BAR należy wstępnie oczyścić oczyszczone białko przez ultrawirowanie i przenieść supernatant do nowej probówki mikrowirówkowej bez naruszania osadu.

Następnie inkubuj cztery mikromole oczyszczonego SNX4-ATG20 i 2,5 milimola liposomów w całkowitej objętości reakcji 20 mikrolitrów przez 30-minutową inkubację w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Aby uwidocznić i określić ilościowo rurkę liposomową, pod koniec inkubacji natychmiast umieść próbki na pokrytej węglem siatce miedzianej i zabarwiej ujemnym z 1% octanem uranylu. Następnie przeanalizuj próbki pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym o napięciu 200 kilowoltów.

W celu wiązania liposomów i sedymentacji przenieś 20 mikrolitrów reakcji do probówki wirówkowej z poliwęglanu i odwiruj próbkę za pomocą kompatybilnego routera w ultrawirówce. Pod koniec wirowania ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki i ponownie zawiesić osad w 40 mikrolitrach buforu próbki stronicowej SDS. Przenieść zawiesinę osadów do nowej probówki do mikrowirówki i dodać 20 mikrolitrów buforu próbki do supernatantu.

Następnie załaduj równoważne objętości próbki osadu i supernatantu na 10% poliakryloamidowy żel stronicowy SDS i wykonaj barwienie Coomassie, aby uwidocznić SNX-BAR związane z liposomami. Aby sprawdzić, czy ekspresja SNX-BAR jest prawidłowa, można użyć western blot przeciwko znacznikowi oczyszczania tandemowego powinowactwa, ponieważ poziomy białek SNX-BAR mogą nie być wykryte za pomocą barwienia Coomassie. Po oczyszczeniu heterodimera SNX-BAR prążki dwóch SNX-BAR powinny pojawić się w stosunku stechiometrycznym jeden do jednego, a prążki zanieczyszczające powinny być niewielkie lub nie powinno być ich wcale.

W tej reprezentatywnej analizie heterodimery SNX-BAR uległy ekspresji, oczyszczeniu i związaniu z syntetycznymi liposomami, jak pokazano. Należy zauważyć, że MVP1 tworzył homodimery i ulegał ekspresji w bakteriach zgodnie z oczekiwaniami. Wiązanie SNX-BAR z różnymi składami liposomów można określić ilościowo za pomocą densytometrii w celu oceny wpływu fosfatydyloseryny, na przykład na wiązanie liposomów.

Obrazowanie mikroskopem elektronowym umożliwia pomiar kanalików liposomowych SNX4-ATG20, przy czym większość kanalików ma zwykle średnice od 14 do 26 nanometrów. Należy pamiętać, że oczyszczone SNX-BAR można rozpuścić za pomocą kompleksów wychwytywania ładunku na liposomach, aby zrozumieć, w jaki sposób pełne zespoły mogą wpływać na przebudowę membrany. Porównując wiązanie różnych kombinacji oczyszczonych dimerów SNX-BAR z syntetycznymi liposomami złożonymi z różnych lipidów, stwierdzono, że białka SNX-BAR mają różne preferencje wiązania lipidów.

Zawsze pracuj pod kapturem podczas pracy z chloroformem i pamiętaj o noszeniu odpowiednich środków ochrony osobistej podczas pracy z ostrymi narzędziami lub materiałem szklanym.