Identyfikacja regulatorów czynników transkrypcyjnych za pomocą średnioprzepustowego badania przesiewowego bibliotek tablicowych i reportera opartego na podwójnej lucyferazie

Protokół ten może być stosowany do badań przesiewowych bibliotek testów lentiwirusowych lub retrowirusowych w celu identyfikacji nowych regulatorów czynników transkrypcyjnych w komórkach nowotworowych. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest szybka, średnio przepustowa i niedroga oraz że wykorzystuje sprzęt i odczynniki powszechnie dostępne dla większości badaczy. Aby rozszerzyć i oczyścić każdy wektor lentiwirusowy w bibliotece, najpierw dodaj 1,3 mililitra bulionu Luria uzupełnionego 100 mikrogramami na mililitr ampicyliny do każdej studzienki 96-dołkowej płytki głębokiej.

Zaszczepić każdą studzienkę dwoma mikrolitrami glicerolu do inkubacji przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 225 obrotów na minutę. Następnego dnia przenieś każdą kulturę bakterii do pojedynczych 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych do odwirowania. Oczyść każdy wektor za pomocą odpowiedniego zestawu do miniprepu bakteryjnego zgodnie z instrukcjami producenta.

Dla każdego wektora w przygotowanej bibliotece zasiej jedną studzienkę 24-dołkowej płytki z jednym razy 10 do piątych komórek 293FT i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny. Aby przygotować mieszaninę transfekcyjną, która zostanie ustawiona dla każdego wektora w bibliotece, najpierw eluuj każdy wektor lentiwirusowy do końcowego stężenia 50 nanogramów na mikrolitr wodą wolną od nukleaz. Przenieść pięć mikrolitrów każdego rozcieńczenia do indywidualnych dołków 96-dołkowej płytki PCR.

Wykonaj super mieszankę transfekcji, mieszając 1,25 mikrolitra razy x odczynnika do transfekcji jeden z 23,75 mikrolitra razy x wstępnie podgrzanego buforu do transfekcji. Inkubować super mieszankę transfekcji w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie dodaj 125 nanogramów razy x psPAX2 i 125 nanogramów razy x VSVG do super mieszanki, delikatnie pipetując.

Natychmiast podwielokrotność super mieszanki do każdej probówki paska PCR i za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 25 mikrolitrów mieszaniny do każdej studzienki rozcieńczonego wektora wirusowego. Po 20-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 30 mikrolitrów każdej mieszaniny transfekcyjnej z każdej studzienki do odpowiedniego dołka składającego się z komórek o długości 293 stóp stopy na uprzednio przygotowanej płytce 24-dołkowej. Inkubować komórki przez 24 godziny przed zastąpieniem pożywki w każdym dołku 500 mikrolitrami świeżej, kompletnej pożywki wzrostowej na kolejną 24-godzinną inkubację w inkubatorze do hodowli komórkowych.

Następnego dnia użyj pipety wielokanałowej, aby zebrać supernatant wirusa z każdej studzienki i podamuluj 220 mikrolitrów każdego supernatantu do dwóch dołków na nowej 96-dołkowej płytce, aby wygenerować ułożoną płytkę supernatantu wirusowego. Aby przygotować komórki A375 do infekcji, należy wysiać od jednej do 10 do piątej komórki na 24-dołkowej płytce w 0,5 mililitra kompletnej pożywki wzrostowej na dołek dla każdego wektora wirusowego w bibliotece. Dołącz dodatkową studzienkę, która nie zostanie zainfekowana, aby służyła jako kontrola przy wyborze leków.

Po 24-godzinnej inkubacji w inkubatorze do hodowli komórkowych rozmrozić zamrożony supernatant lentiwirusowy ustawiony na temperaturę pokojową przed zastąpieniem pożywki wzrostowej z każdej studzienki przygotowanej płytki do hodowli komórkowej 200 mikrolitrami pożywki wzrostowej uzupełnionej 20 mikrogramami na mililitr polibrenu. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 200 mikrolitrów supernatantu wirusowego z każdego 96 dołków do każdego dołka 24-dołkowej. Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na 24 do 48 godzin.

Pod koniec inkubacji zastąp pożywkę w każdym dołku 500 mikrolitrami pożywki wzrostowej uzupełnionej puromycyną i włóż komórki z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych na dodatkowe 48 godzin. Po 48-godzinnej selekcji puromycyny posortuj komórki na trzy lub cztery grupy, tak aby wszystkie studzienki w jednej grupie miały podobną gęstość komórek i dodaj 200 mikrolitrów trypsyny-EDTA do jednego dołka reprezentatywnego z każdej grupy na pięciominutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po odłączeniu komórek zneutralizuj trypsynę za pomocą 400 mikrolitrów pożywki wzrostowej uzupełnionej puromycyną i policz liczbę komórek z każdej trypsynizowanej studni.

Rozcieńczyć każdą zawiesinę komórkową do stężenia dwa razy 10 do piątego na mililitr pożywką wzrostową uzupełnioną puromycyną i zasiać 500 mikrolitrów komórek z każdej studzienki w tej samej pozycji dołka na nowej 24-dołkowej płytce. Po wykorzystaniu liczb z każdej reprezentatywnej studzienki do oszacowania liczby komórek w każdym pozostałym studzienku w każdej grupie, dodaj odpowiednią objętość trypsyny-EDTA do każdej studzienki, aby osiągnąć stężenie od jednego razy 10 do szóstego komórek na mililitr. Podczas trypsynizacji użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 400 mikrolitrów pożywki wzrostowej uzupełnionej puromycyną do odpowiednich dołków w nowej 24-dołkowej płytce.

Po odłączeniu komórek delikatnie wymieszaj zawartość każdej studzienki i przenieś 100 mikrolitrów każdej zawiesiny komórek do odpowiedniego odpowiedniego dołka w nowej 24-dołkowej płytce. Następnie należy umieścić komórki z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na 24 godziny. Aby transfekować komórki konstruktami reporterowymi podwójnej lucyferazy, należy przygotować mieszaninę rozcieńczania transfekcji, jak wskazano w tabeli.

Aby przygotować mieszaninę rozcieńczania reporterowego, należy wymieszać objętości każdego odczynnika pomnożone przez całkowitą liczbę transfekcji plus kilka dodatkowych objętości. Następnie wymieszać mieszaninę rozcieńczającą transfekcję z mieszaniną rozcieńczania reporterowego i inkubować otrzymany roztwór w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby uzyskać mieszaninę transfekcji. Podczas inkubacji przepłukać każdą studzienkę płytki do hodowli komórkowej 250 mikrolitrami PBS i dodać 447 mikrolitrów świeżej, kompletnej pożywki wzrostowej do każdej studzienki.

Następnie za pomocą pipety wielokanałowej rozprowadź 53 mikrolitry mieszanki transfekcyjnej do każdej studzienki płytki do hodowli komórkowej. Umieść płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na 24 godziny. Aby zmierzyć aktywność lucyferazy, rozcieńczyć 5X pasywny bufor do lizy z zestawu aktywności lucyferazy w rozcieńczeniu od jednego do pięciu wodą dejonizowaną i rozmrozić niezbędne objętości odczynnika A i buforu odczynnika B z zestawu.

Gdy odczynniki są gotowe, zastąpić supernatant w każdym dołku 75 mikrolitrami pasywnego buforu do lizy i inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej, od czasu do czasu wstrząsając. Podczas inkubacji rozcieńczyć 50-krotny substrat odczynnika B z zestawu do stężenia 1 do 50 za pomocą rozmrożonego buforu odczynnika B. Pod koniec inkubacji dodać 30 mikrolitrów pasywnego buforu do lizy do czterech ślepych studzienek kontrolnych i przenieść 30 mikrolitrów lizatu z każdej studzienki do zduplikowanych studzienek 96-dołkowej białej płytki do oznaczania z płaskim dnem.

Gdy cały lizat zostanie platerowany, użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 50 mikrolitrów odczynnika A do każdej studzienki i odczytać sygnał lucyferazy świetlika za pomocą czytnika płytek. Następnie za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 50 mikrolitrów odczynnika B do każdej studzienki i odczytaj sygnał lucyferazy Renilla za pomocą czytnika płytek. Zgodnie z oczekiwaniami, YAP2SA zwiększa aktywność lucyferazy świetlika, ale nie aktywność lucyferazy Renilla w porównaniu z wektorem kontrolnym.

W przeciwieństwie do tego, YAP2SA S94A nie zwiększa aktywności lucyferazy świetlików. Co ważne, YAP2SA nie zmienia aktywności minimalnego konstruktu promotorowego, który nie ma elementów wiążących MCAT TEAD. W komórkach transfekowanych konstruktem reporterowym YAP-TAZ-TEAD tandemowe krótkie spinki do włosów YAP i TAZ znacznie obniżyły poziom lucyferazy świetlika, ale kontrolna kontrola krótkiej spinki do włosów bez celowania nie.

W przeciwieństwie do tego, w komórkach transfekowanych minimalnym konstruktem reporterowym, krótki RNA spinki do włosów YAP-TAZ nie zmienia znacząco poziomów lucyferazy świetlika. Sygnał Renilla w każdym dołku nie jest również znacząco zmieniony przez kontrolę krótkiej spinki do włosów bez celowania lub RNA krótkiej spinki do włosów YAP-TAZ. Zgodnie z oczekiwaniami, krótkie RNA spinki do włosów ukierunkowane na kinazę YAP i TAZ, SARC lub PI3 znacznie zmniejszają aktywność YAP-TAZ-TEAD.

Krótkie spinki do włosów RNA ukierunkowane na ATM, CDH1, CSK, ERBB2 i żelsolinę zwiększały znormalizowane poziomy lucyferazy świetlika, zgodnie z opublikowanymi badaniami wykazującymi, że białka te były YAP i / lub TAZ. Pomimo ustalonych ról ATR, CCNE2 i ERBB4 w innych typach komórek, krótkie RNA spinki do włosów ukierunkowane na te geny nie zmieniają znacząco znormalizowanych poziomów lucyferazy świetlika w komórkach A375. Po tym ekranie należy zweryfikować identyfikację regulatorów przy użyciu innych odczytów pod kątem ich aktywności czynnika transkrypcyjnego.

Należy również potwierdzić skuteczne knockdown zidentyfikowanego regulatora za pomocą testu. Należy pamiętać o zachowaniu ostrożności i przestrzeganiu wytycznych bezpieczeństwa podczas pracy z zakaźnymi lentiwirusami, zwłaszcza jeśli wirusy są zakaźne dla ludzi.