Lokalizacja i kwantyfikacja begomowirusów w tkankach mączlika metodą immunofluorescencji i ilościowego PCR

Wyjaśnienie przestrzenności i ilości wirusa w wektorach mączlika może pomóc w zrozumieniu interakcji między begomowirusem a mączlikiem oraz w opracowaniu nowych strategii zwalczania poważnych chorób begomowirusowych. Zaletą tej techniki jest to, że możemy szybko wyizolować tkanki mączlika, kolokalizować białka wirusa i mączlika oraz określić ilościowo wirusy w całych ciałach mączlika i roślinach zakażonych wirusem. W odpowiednim eksperymentalnym punkcie czasowym, po przejęciu wirusa, umieść znieczulone lodem samice mączlików w kropli PBS na szkiełku mikroskopowym i użyj cienkiej igły do akupunktury, aby otworzyć brzuch mączlika pod mikroskopem stereoskopowym.

Użyj igły, aby wyekstrahować jelito środkowe i umieść je w naczyniu zbiorczym PBS. Aby zebrać PSG, podziel ciało w klatce piersiowej od strony grzbietowej w pobliżu głowy i przymocuj mączlika igłą przez klatkę piersiową. Użyj drugiej igły, aby potrząsnąć mączlikiem, aż dwa gruczoły ślinowe zostaną oddzielone od ciała i przenieś gruczoły do nowego naczynia z PBS.

Aby zebrać jajniki, całkowicie otwórz brzuch i użyj igły, aby oddzielić jajniki od innych tkanek. Użyj pipety, aby usunąć nadmiar tkanki i przenieś jajniki do nowego naczynia z PBS. Aby pobrać próbkę hemolimfy, dodaj 10 mikrolitrów PBS na nowe szkiełko mikroskopowe i umieść nowego mączlika w kropli.

Użyj cienkiej igły do akupunktury, aby delikatnie zrobić otwór w jamie brzusznej. Następnie lekko uciskaj brzuch, aby uwolnić hemolimfę do buforu i zbierz ośmiolitrową próbkę płynu. Aby uwidocznić lokalizację TYLCV w pobranych mączlikach PSG, jelitach środkowych lub tkankach jajnika, przenieś od 15 do 20 próbek na szklaną 3,5-centymetrową szalkę Petriego i odessaj nadmiar buforu.

Utrwal tkanki w jednym mililitrze 4% paraformaldehydu przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, a następnie ostrożnie umyj próbki trzy razy przez dwie minuty w jednym mililitrze świeżego TBS na pranie. Po ostatnim praniu należy przepuścić próbki jednym mililitrem 0,5% Triton X-100 przez 30 minut przed trzykrotnym myciem, jak właśnie wykazano przy użyciu jednego mililitra TBST na pranie. Po ostatnim przemyciu zablokować wszelkie niespecyficzne wiązania jednym mililitrem 1% albuminy surowicy bydlęcej przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, a następnie trzy płukania w TBST, jak pokazano.

Po ostatnim praniu oznacz komórki pierwszorzędowymi przeciwciałami będącymi przedmiotem zainteresowania przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza chronionej przed światłem. Następnego ranka przemyj próbki trzykrotnie TBST przed dodaniem odpowiednich przeciwciał drugorzędowych przez dwie godziny w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem. Pod koniec inkubacji umyj jelito środkowe trzy razy i przenieś próbki do czystego szkiełka mikroskopowego.

Usuń jak najwięcej buforu i zabarwić jądra jedną kroplą DAPI przed zamontowaniem szkiełka nakrywkowego i zbadaniem znakowanych tkanek za pomocą mikroskopii konfokalnej. W celu ilościowego określenia TYLCV należy przemyć zebrane próbki tkanek mączlika dwa do trzech razy w świeżym PBS i przenieść 20 jelit środkowych, 20 PSG lub jeden jajnik w pięciu mikrolitrach PBS do pojedynczych probówek PCR zawierających 25 mikrolitrów roztworu do lizy. Dodaj pięć do siedmiu kulek ceramicznych o średnicy dwóch milimetrów do każdej probówki i zmiel próbki w homogenizatorze.

Dodaj jedną ośmiomikrolitrową próbkę hemolimfy do nowej probówki do PCR i dodaj 10 mikrolitrów lizy do probówki po dokładnym wymieszaniu. Inkubować wszystkie próbki w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez godzinę, a następnie 10-minutową inkubację w temperaturze 100 stopni Celsjusza i krótkie odwirowanie. Następnie dodaj 18 mikrolitrów mieszanki wzorcowej do fiolek z ilościowymi probówkami paskowymi do PCR i dodaj dwa mikrolitry każdej próbki DNA do co najmniej trzech fiolek.

Po załadowaniu wszystkich próbek zamknąć probówki i odwirować w celu osadzenia roztworu na dnie każdej fiolki. Załaduj fiolki do termocyklera w czasie rzeczywistym w celu ilościowego PCR, wybierając cyber jako barwnik fluoroforowy i nieznany jako typ próbki. Następnie wyeksportuj dane ilościowe do arkusza kalkulacyjnego w celu analizy względnej ilości wirusowego DNA w każdej próbce.

Tutaj pokazano reprezentatywne obrazy TYLCV w barwieniu DAPI w PSG mączlika, jelicie środkowym i jajnikach. Jak zaobserwowano, TVLCV wykazuje większą akumulację w PSG i jelicie środkowym niż w jajnikach. Kwantyfikacja wirusa w PSG mączlika, jelicie środkowym, hemolimfie i jajnikach po karmieniu pomidorem zakażonym TYLCV przez 24, 48 i 72 godziny wskazuje, że ilość wirusa wzrasta w różnych tkankach mączlika w bezpośredniej korelacji ze wzrostem okresu dostępu do nabycia.

Najlepiej używać świeżych mączlików, ponieważ martwe owady zwiększą trudność sekcji. Po tej procedurze można przeprowadzić inne analizy, takie jak western blotting i koimmunoprecypitacja, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące ekspresji białek wirusowych oraz interakcji między wirusem a białkiem wektorowym.