Strategiczne badania przesiewowe i charakterystyka wizualnego kompleksu sygnalizacji białkowej GPCR-mini-G w celu pomyślnej krystalizacji

Transdukcja sygnału jest jednym z najważniejszych tematów w badaniach biologicznych i farmaceutycznych. Wymaga białek błonowych do przekazywania sygnałów do białka partnera sygnalizacji wewnątrzkomórkowej. Protokół ten ma na celu przeprowadzanie systematycznego badania przesiewowego detergentów w celu przygotowania kompleksu sygnalizacyjnego mającego na celu określenie struktury.

Protokół ten wykorzystuje powszechnie dostępne techniki w uznanym laboratorium biologicznym i może być łatwo wykonany przez początkujących w tej dziedzinie. Skomponowaliśmy te metody, aby znaleźć najbardziej krytyczny parametr w przygotowaniu kompleksu białek błonowych. Na początek rozmrozić 30 gramów HEK293 GNT z niedoborem komórek do temperatury pokojowej i przenieść do zlewki.

Dodać 120 mililitrów buforu PBS zawierającego koktajl inhibitorów proteazy i homogenicznych za pomocą homogenizatora Dounce lub homogenizatora elektrycznego przy 13 000 obr./min przez 30 sekund. Dostosuj głośność do 150 mililitrów za pomocą bufora PBS. Delikatnie dodaj 10% DDM do homogenizowanych komórek, aby uzyskać końcowe stężenie 1,25%Mieszaj na lodzie przez godzinę.

Po rozpuszczeniu odwiruj lizat komórkowy w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 150 000 razy G przez 45 minut, aby usunąć nierozpuszczone zanieczyszczenia. Przenieś supernatant do 500-mililitrowej butelki i dodaj 10 mililitrów żywicy agarozowej o powinowactwie immunologicznym 50%1D4. Delikatnie mieszaj rozpuszczony lizat komórkowy i żywicę przez cztery godziny lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby umożliwić wiązanie białek.

Załaduj mieszaninę żywicy lizatu do otwartej kolumny, aby zebrać żywicę. Przepłukać żywicę 10 objętościami kolumny buforu płuczącego A w celu usunięcia zanieczyszczenia białkowego. Zamknąć zawór i ponownie zawiesić żywicę z dwiema objętościami buforu A. Następnie, w warunkach przyćmionego czerwonego światła, dodać 9-cis Retinal do zawieszonej żywicy do końcowego stężenia 50 mikromolowych.

Delikatnie mieszaj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez cztery do 16 godzin w ciemności, aby związać siatkówkę. Następnie otwórz wartość i usuń bufor z kolumny. Przemyj żywicę 20 objętościami buforu A, a następnie 15 objętościami buforu B w celu usunięcia niezwiązanego Retinalu.

Ponownie zawiesić żywicę w dwóch objętościach kolumny buforu B, a następnie podzielić zawiesinę żywicy równo na 10 10-mililitrowych kolumn do utylizacji. Usuń bufor z 10 kolumn, a następnie ponownie zawieś żywicę w jednym mililitrze buforu C w celu wymiany detergentu. Inkubować przez godzinę na lodzie.

Powtórzyć płukanie i inkubację w buforze C jeszcze raz. Usuń bufor z kolumn, a następnie ponownie zawieś żywicę w 0,8 mililitra buforu elucyjnego na każdą kolumnę. Delikatnie mieszaj przez dwie godziny.

Zebrać elucję z każdej kolumny do probówki. Zawiesić żywicę w 0,7 mililitra buforu elucyjnego na każdą kolumnę. Delikatnie mieszaj przez godzinę.

Zebrać elucję z każdej kolumny do tych samych probówek. W ciemności załaduj wymykające się białko do kuwety kwarcowej. Zmierzyć widmo próbki białka.

Oświetl białko bezpośrednio w kuwecie przez dwie minuty światłem przechodzącym przez filtr przepustowy o długości 495 nanometrów. Zmierzyć widmo oświetlonej próbki. Wykonać ten sam pomiar dla wszystkich próbek białka oczyszczonych w pozostałych dziewięciu detergentach.

Zarówno stany ciemne, jak i oświetlone. W normalnym świetle dla każdego detergentu przygotuj 100 mikrolitrów rodopsyny w stężeniu 0,7 miligrama na mililitr. W przyćmionym czerwonym świetle przygotuj 100 mikrolitrów mieszaniny rodopsyny w stężeniu 0,7 miligrama na mililitr i mini-GO w stężeniu 0,2 miligrama na mililitr.

Uzupełnij mieszaninę jednym milimolowym chlorkiem magnezu. Oświetlić mieszaninę światłem z filtra przepustowego o długości 495 nanometrów i inkubować przez 30 minut. Przenieść próbki do fiolek z automatycznym samplerem i umieścić je w tacy na próbki.

Zaprogramuj plik metody, aby zautomatyzować sekwencyjne przebiegi SEC dla każdej próbki, przy czym automatyczny próbnik ładuje 77 mikrolitrów próbki do kolumny, a oczyszczacz unika 25 mililitrów bufora SEC na przebieg. Zapisz absorbancję przy 280 nanometrach i 380 nanometrach. Zbierz frakcje szczytowe rodopsyny i kompleksu rodopsyny-mini-GO w objętości retencji około 12,9 mililitra.

Analizuj lewe próbki rodopsyny i frakcje szczytowe kompleksu rodopsyna-mini-GO na czterech do 12% denaturujących żelach gradientowych SDS z niebieskim barwieniem Coomassie. Przygotuj mieszaninę 200 mikrolitrów rodopsyny w ilości jednego miligrama na mililitr i PNGazy F w ilości 0,01 miligrama na mililitr. Dobrze wymieszaj i inkubuj na lodzie przez noc.

Przygotuj 200 mikrolitrową mieszaninę rodopsyny w ilości jednego miligrama na mililitr i Endo F1-13 w ilości 0,01 miligrama na mililitr. Dobrze wymieszaj i inkubuj na lodzie przez noc. Przeanalizuj wynik trawienia za pomocą SDS-Page i barwienia na niebiesko Coomassie.

W tym badaniu konfiguracja oczyszczania na małą skalę dostarczyła wystarczającą ilość białka do dalszych analiz. Widma rodopsyny w ultrafiolecie w świetle widzialnym pokazują ciemny stan 9-cis rodopsyny związanej z siatkówką na niebieskich krzywych. Po rozświetleniu 9-cis Retinal ulega deproteinizacji i izomeryzuje do wszystkich trans-retinalów.

Proporcje absorbentów o długości 280 nanometrów nad absorbentami o długości 488 nanometrów i absorbentów o długości 280 nanometrów nad absorbentami o długości 380 nanometrów obrazują stabilność rodopsyny oczyszczonej w każdym detergencie. Przedstawiono profile chromatografii wykluczającej wielkość rodopsyny i kompleksu rodopsyny-mini-GO oczyszczonych w 10 różnych detergentach. Profil standardowych białek markerowych jest przedstawiony jako nakładka wraz z próbką DDM.

Interpretacja profili pików jest pokazana dla DMNG z idealnym scenariuszem widzianym dla DDM, DM, Cymal-6, Cymal-5 i OGNG. Powiększony profil próbki OGNG pokazuje, że zarówno rodopsyna, jak i kompleks rodopsyna-mini-GO wymykają się mniej więcej tej samej objętości retencji. Analiza SDS-Page rodopsyny i oczyszczonych przez SEC próbek kompleksu rodopsyny-mini-GO jest pokazana tutaj.

Rysunek ten przedstawia analizę deglikozylacji rodopsyny za pomocą enzymów Endo F1 i PNGazy F. Bardzo ważne jest, aby przeprowadzać badania przesiewowe detergentów w sposób systematyczny, tak aby można było wyraźnie i jednoznacznie porównać wpływ każdego detergentu z osobna. W przypadku białek o różnej ilości test przesunięcia termicznego można również zastosować do zbadania wpływu detergentu na stabilność białka.

Dzięki tej metodzie jesteśmy w stanie przygotować stabilny kompleks białkowy i ostatecznie rozwiązać strukturę krystaliczną utraconą w geomontażu. Dostarczyło to ważnych informacji na temat swoistości interakcji białka GPCR-G.