Pomiar interakcji międzykomórkowych poprzez agregację białek w heterologicznym systemie komórkowym
22 maja 2020
Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół do szybkiego i półilościowego pomiaru interakcji ligand-receptor w trans w heterologicznym systemie komórkowym za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
Test oparty na komórkach pozwala na obserwację i kwantyfikację interakcji adhezji trans bez konieczności długotrwałego oczyszczania białek lub specjalistycznego sprzętu. Chociaż badane tutaj interakcje białkowe są istotne dla neurobiologii, metoda ta może być stosowana w dowolnym obszarze badań, w którym adhezja białek zachodzi międzykomórkowo. 48 godzin po transfekcji komórek HEK-293T należy pobrać komórki z płytki sześciodołkowej w celu agregacji.
Najpierw umyj każdą studzienkę dwukrotnie PBS. Następnie, aby delikatnie oddzielić komórki, dodaj jeden mililitr 10 milimolowego EDTA do każdej studzienki, a następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po pięciu minutach inkubacji delikatnie postukaj w płytkę, aby odłączyć komórki i zbierz każdą studzienkę do osobnej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów.
Odwirować probówki o sile 500 x g w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Podczas gdy komórki granulują, przygotuj sześć probówek inkubacyjnych, oznaczając górne części probówek do mikrowirówek warunkami eksperymentalnymi. Należy użyć każdej permutacji GFP i mCherry.
Usunąć supernatant z 15-mililitrowych stożkowych probówek i ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach pożywki. Za pomocą hemocytometru policz komórki w każdej stożkowej probówce. Następnie podwielokrotnić 200 000 komórek z każdego stanu do odpowiedniej probówki inkubacyjnej, aby uzyskać mieszaninę jeden do jednego w całkowitej objętości 500 mikrolitrów.
Po dokonaniu oceny agregacji linii podstawowej opisanej w następnym rozdziale, należy umieścić probówki inkubacyjne w powolnym rotatorze probówek w temperaturze pokojowej. Aby ocenić agregację, na początku badania i ponownie po 60 minutach, należy odpipetować 40 mikrolitrów z probówki inkubacyjnej na naładowane szkiełko mikroskopowe. Akwizycja wyjściowa powinna być wykonana tak szybko, jak to możliwe po dodaniu komórek do probówki mikrowirówkowej.
Wyobraź sobie slajd pod wpływem fluorescencji zarówno w kanale zielonym, jak i czerwonym. Dla każdego slajdu uchwyć obrazy trzech różnych pól widzenia w jednej płaszczyźnie ogniskowej. Komórki HEK-293T transfekowano białkiem będącym przedmiotem zainteresowania, zmutowanym białkiem lub ligandem będącym przedmiotem zainteresowania i współtransfekowano białkiem fluorescencyjnym.
Populacje komórek wyrażające białko będące przedmiotem zainteresowania zmieszano z populacjami komórek wyrażającymi interesujący ligand i oceniono pod kątem agregacji po 60 minutach. W nakładkach obrazów przechwyconych w kanałach zielonym i czerwonym agregacja jest wyświetlana jako żółta kropka. Warunki, w których komórki nie wykazywały ekspresji żadnych ligandów synaptycznych, wykazywały minimalną agregację.
Wykazano również minimalną agregację, gdy tylko jedna z dwóch populacji wykazywała ekspresję ligandów synaptycznych. Nie wykazano agregacji, gdy dwie populacje komórek wyrażały niezgodne cząsteczki adhezyjne. Warunki z kompatybilnymi cząsteczkami adhezyjnymi wykazywały znaczną agregację po 60-minutowej inkubacji.
Co zaskakujące, zmutowane białko wykazywało znacznie większą agregację niż jego odpowiednik typu dzikiego, co sugeruje, że mutacja punktowa zwiększa zdolności wiązania białek. Mutacje w wielu cząsteczkach adhezyjnych są powszechnie związane z zaburzeniami neurorozwojowymi, neuropsychiatrycznymi i uzależnieniami. Dzięki tej technice można badać wpływ mutacji punktowych istotnych dla choroby na interakcje trans.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia zoptymalizowany protokół do szybkiego i półilościowego pomiaru oddziaływań ligand-receptor w układzie trans, z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej w komórkach HEK-293T. Metoda ta umożliwia kwantyfikację oddziaływań adhezyjnych białek istotnych dla neurobiologii oraz potencjalnie innych dziedzin badawczych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Adhezja komórkowa
- Interakcje białkowe
Wstęp
- Oddziaływania ligand-receptor są kluczowe dla komunikacji komórkowej.
- Zrozumienie tych oddziaływań pomaga wyjaśnić mechanizmy zaburzeń neurorozwojowych i neuropsychiatrycznych.
- Tradycyjne metody mogą wymagać rozległego oczyszczania białek lub specjalistycznego sprzętu.
- Niniejsze badanie proponuje bardziej wydajne podejście z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej.
Cel badania
- Opracowanie szybkiego i skutecznego protokołu badania adhezji białek w teście opartym na komórkach.
- Ocena wpływu mutacji punktowych w białkach na oddziaływania typu trans.
- Szerokie zastosowanie tej metody w badaniach nad adhezją białek poza zakresem neurobiologii.
Zastosowane metody
- Do obrazowania oddziaływań komórkowych wykorzystano mikroskopię fluorescencyjną.
- Jako model biologiczny zastosowano komórki HEK-293T, koncentrując się na transfekowanych białkach i ligandach.
- Harmonogram eksperymentu obejmował ocenę agregacji komórek 60 minut po transfekcji.
- Zliczanie komórek przeprowadzono przy użyciu hemocytometru, a następnie wykonano resuspensję i wymieszanie komórek w celu obrazowania.
Główne wyniki
- Agregacja komórek wykazujących ekspresję kompatybilnych cząsteczek adhezyjnych uległa znacznemu nasileniu po 60 minutach.
- Białka zmutowane wykazywały większą agregację w porównaniu z odpowiednikami typu dzikiego, co wskazuje na poprawę zdolności wiązania.
- Minimalną agregację zaobserwowano w przypadku, gdy żadna lub tylko jedna populacja wykazywała ekspresję ligandów synaptycznych.
Wnioski
- Niniejsze badanie prezentuje usprawnioną metodę oceny międzykomórkowych oddziaływań adhezyjnych.
- Wyniki podkreślają potencjał tej techniki w badaniu wpływu mutacji na oddziaływania białkowe.
- Wnioski z tej metody są cenne dla zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw różnych zaburzeń neuropsychologicznych i neurorozwojowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten test umożliwia bezpośredni pomiar trans-oddziaływań białko-białko w kontekście komórkowym, rozwiązując kluczowe ograniczenie testów biochemicznych, które nie potrafią odróżnić wiązania cis od trans. Poprzez kwantyfikację wyłącznie fizjologicznie istotnej adhezji międzykomórkowej, metoda ta zwiększa pewność walidacji celu i redukuje liczbę wyników fałszywie dodatnich we wczesnej fazie odkrywania. Wspiera ona mechanistyczną redukcję ryzyka w badaniach nad celami adhezyjnymi zaangażowanymi w zaburzenia neurorozwojowe i neuropsychiatryczne.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez pomiar funkcjonalnej adhezji trans między parami ligandu i receptora ekspresowanymi na oddzielnych komórkach.
- Wartość operacyjna: Eliminuje konieczność oczyszczania białek, umożliwiając szybki screening mutantów lub wariantów bezpośrednio w systemie komórkowym.
- Wartość prognostyczna: Zwiększona agregacja w przypadku mutacji związanej z chorobą wykazuje, w jaki sposób test może identyfikować warianty typu gain-of-function w celu ich priorytetyzacji.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość analizy: Wykorzystanie komórek HEK znakowanych fluorescencyjnie pozwala na uzyskanie mierzalnych wyników obrazowania (np. żółte punkty w nałożonych obrazach) w celu adaptacji do wysokoprzepustowego screeningu obrazowego (high-content screening).
- Powtarzalność: Standaryzacja mieszania komórek i warunków inkubacji umożliwia spójny pomiar agregacji w różnych eksperymentach.
- Skalowalność: Protokół umożliwia równoległe testowanie wielu warunków (np. typu dzikiego w porównaniu z mutantem, różnych kombinacji ligandów) dzięki prostym etapom mieszania i obrazowania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Pozwala na bezpośrednie badanie, w jaki sposób mutacje punktowe w cząsteczkach adhezyjnych — powszechne w zaburzeniach neurorozwojowych, neuropsychiatrycznych i uzależnieniach — wpływają na oddziaływania typu trans.
- Ciągłość translacyjna: Łączy testy wiązania in vitro z fenotypami komórkowymi, wspierając decyzje typu go/no-go w oparciu o funkcjonalne dane dotyczące adhezji.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Pozwala zidentyfikować, czy mutacje wzmacniają, czy zaburzają wiązania międzykomórkowe, co dostarcza informacji o mechanizmie działania celu oraz profilu bezpieczeństwa.
Integracja potoku i przepływu pracy
Test ten uzupełnia lukę między przesiewaniem zaangażowania celu a walidacją funkcjonalną, dostarczając danych specyficznych dla adhezji, które służą do optymalizacji związków wiodących i wyboru kandydatów do badań przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Pozwala sprawdzić, czy warianty genetyczne zmieniają adhezję międzykomórkową, co wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych i walidację hipotez dotyczących celów terapeutycznych.
- Analityka: Generuje ilościowe odczyty oparte na obrazowaniu (tworzenie agregatów w czasie) w celu porównania warunków i oceny siły oddziaływań.
- Badania translacyjne: Łączy zmiany molekularne z fenotypami komórkowymi istotnymi dla tworzenia synaps i łączności neuronalnej.
- Zastosowanie w przedsiębiorstwach: Możliwość adaptacji do dowolnego systemu adhezji białek międzykomórkowych, co czyni tę metodę platformą wielokrotnego użytku w różnych obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Pomiar dotyczy wyłącznie oddziaływań typu trans, co ogranicza zawyżanie poziomu wiązania obserwowane w testach opartych na lizatach i zwiększa specyficzność wobec celu.
- Wartość operacyjna: Metoda wykorzystuje standardowe hodowle komórkowe i mikroskopię fluorescencyjną, nie wymagając specjalistycznego sprzętu ani złożonych odczynników.
- Wartość strategiczna: Umożliwia szybką ocenę wpływu mutacji na funkcję celu, co wspiera lepsze podejmowanie decyzji go/no-go w procesie identyfikacji związków wiodących.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez identyfikację wariantów o zmienionej adhezji, które mogą wpływać na skuteczność lub toksyczność.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w transfekcji komórek ssaków, znakowaniu białek fluorescencyjnych oraz w cytometrii przepływowej lub liczeniu komórek za pomocą hemocytometru.
- Zależne od mikroskopii fluorescencyjnej z możliwością obrazowania dwukanałowego (np. GFP i mCherry) oraz narzędzi do analizy obrazu w celu kwantyfikacji agregatów.
- Wymaga standaryzacji poziomów ekspresji komórkowej i stosunków mieszania w celu zapewnienia powtarzalnych wyników agregacji w różnych zespołach.
- Adaptacja do systemów innych niż HEK może wymagać optymalizacji wydajności transfekcji oraz powierzchniowej ekspresji cząsteczek adhezyjnych.
- Ograniczone do oceny adhezji; nie raportuje sygnałów wewnątrzkomórkowych ani zdarzeń internalizacji następujących po wiązaniu.
