Biomimetyczna replikacja mikrostruktury powierzchni korzenia przy użyciu zmiany miękkiej litografii
5 sierpnia 2020
Biomimetyka była wcześniej używana jako narzędzie do badania interakcji między liśćmi a mikroorganizmami. Jednak takie narzędzie nie istnieje dla korzeni. W tym miejscu opracowujemy protokół tworzenia syntetycznych powierzchni naśladujących mikrostrukturę powierzchni korzenia w celu badania interakcji między korzeniami a środowiskiem.
Protokół ten umożliwia opracowanie syntetycznego systemu naśladującego mikrostrukturę powierzchni korzenia. System może być wykorzystywany do badania interakcji między korzeniami a środowiskiem w sposób kontrolny, z naciskiem na strukturę powierzchni. Jest to prosta technika, którą można wykonać w dowolnym laboratorium badającym interakcje między korzeniami a środowiskiem.
Dodatkowo technika ta umożliwia formowanie powierzchni z różnych materiałów. Najtrudniejszym krokiem jest usunięcie naturalnego korzenia z pleśni ujemnej. Ten krok wymaga delikatnego obchodzenia się z korzeniem, aby uniknąć rozdarcia włośników.
Demonstracja wizualna zwiększy zdolność widza do odtworzenia tej procedury. Zacznij od usunięcia rośliny z gleby po trzech tygodniach wzrostu. Odetnij system korzeniowy od rośliny w miejscu interakcji z łodygą i umieść roślinę bez korzeni w zlewce z wodą.
Po kilku dniach odetnij korzenie przybyszowe, które wyłaniają się z łodygi i użyj ich do replikacji. Aby przygotować kiełkujące korzenie nasion, zwilż bibułę filtracyjną wewnątrz szalki Petriego wodą i umieść kilka nasion M82 na papierze. Inkubuj naczynie w temperaturze 25 stopni Celsjusza i codziennie nawadniaj papier.
Około pięć dni później kiełkujące korzenie będą wystarczająco długie, aby można je było wykorzystać do replikacji. Przygotować ujemny roztwór repliki, dodając 9,49 grama dimetarylanu diuretanu do 50-mililitrowego kubka. Dodaj 1,45 mililitra metakrylanu etylu do kubka i przechowuj w temperaturze pokojowej, aż roztwór stanie się jednorodny i będzie klarowny.
Dodaj trzy mililitry plastyfikatora i mieszaj roztwór przez kolejną godzinę. Następnie dodaj 300 mikrolitrów inicjatora fotograficznego i mieszaj przez noc lub do momentu, gdy wszystkie bąbelki zostaną usunięte. Aby wygenerować ujemną replikę korzenia, weź czyste szklane szkiełko i wlej na nie jeden mililitr roztworu repliki negatywu.
Umieść dwa do trzech korzeni nad roztworem, upewniając się, że korzenie nie są całkowicie zakryte. Trzymaj szkiełko pod ośmiowatową lampą ultrafioletową przez osiem do 10 minut, a następnie wyłącz lampę UV. Zdejmij replikę ze szkiełka i umieść ją na szalce Petriego wypełnionej etanolem w celu usunięcia nieprzereagowanego monomeru.
Za pomocą kleszczy powoli i delikatnie usuwaj korzeń z repliki. Aby przygotować roztwór PDMS dla repliki dodatniej, umieść 10 gramów dimetylosiloksanu w filiżance. Dodaj jeden gram utwardzacza i dokładnie wymieszaj.
Podgrzewać mieszaninę w eksykatorze pod próżnią przez dwie godziny, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Umieścić poliuretanową replikę negatywu na szalce Petriego i wylać mieszaninę PDMS na wierzch repliki negatywu. Zastosuj próżnię przez dwie godziny, aby zapewnić pokrycie mikrostruktury i utrzymuj szalkę Petriego w temperaturze pokojowej przez noc.
Następnego dnia należy oddzielić utwardzoną replikę dodatnią od repliki ujemnej za pomocą kleszczy. Aby przygotować pozytywową replikę z etylocelulozy, dodaj 20 mililitrów etanolu do 100-mililitrowego kubka. Następnie dodaj 1,32 mililitra plastyfikatora i 3,3 grama etylocelulozy.
I mieszaj roztwór w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Następnego dnia wylej roztwór etylocelulozy na wierzch negatywu na szalkę Petriego i pozostaw szalkę pod maską na noc. Następnie powoli wyjmij replikę pozytywową z repliki negatywowej za pomocą kleszczy.
Dobrą ujemną replikę można wygenerować, jeśli protokół jest przestrzegany poprawnie. Ta replika pokaże strukturę komórkową powierzchni korzenia, a także otwory reprezentujące lokalizację włośników. Jeśli korzeń zostanie zanurzony w roztworze poliuretanu, zostanie uwięziony w twardym polimerze i pozostanie w replice negatywu po jego utwardzeniu.
Podczas utwardzania światłem UV, przekroczenie zalecanego czasu utwardzania, spowoduje powstanie niezwykle twardej formy poliuretanowej, uniemożliwiającej usunięcie korzenia bez jego złamania. Czasami kawałki korzeni są tak małe, że aby je zobaczyć, wymagana jest mikroskopia. Dodatnie repliki wygenerowano za pomocą PDMS i etylocelulozy.
Włośniki znajdują się w strefie wydłużenia, w której zaczynają się wyłaniać. Ich długość zmienia się wzdłuż powierzchni korzenia, gdy stają się dłuższe, podobnie jak naturalny korzeń. Niektóre z włosów na replice etylocelulozy są nawet widoczne pod mikroskopem świetlnym.
Podczas umieszczania korzenia nad roztworem repliki ujemnej ważne jest, aby wybrać właściwą stronę i unikać zanurzenia korzenia w roztworze. Technika ta została opracowana, aby zapewnić nową drogę do badania interakcji środowiskowych na powierzchni korzeni. W szczególności siły fizyczne wywołane mikrostrukturą i właściwościami materiałowymi powierzchni.
Przegląd
Niniejszy protokół umożliwia opracowanie syntetycznych powierzchni naśladujących mikrostrukturę powierzchni korzenia, co ułatwia kontrolowane badania oddziaływań między korzeniem a środowiskiem. Technika ta jest prosta i może być zastosowana w każdym laboratorium zajmującym się badaniami korzeni.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biomimetyka
- Biologia roślin
- Mikrostruktura korzenia
Wprowadzenie
- W poprzednich badaniach wykorzystywano biomimetykę do analizy oddziaływań między liśćmi a mikroorganizmami.
- Nie istniały żadne dostępne narzędzia do badania oddziaływań korzeni.
- Niniejsze badanie wypełnia tę lukę poprzez stworzenie syntetycznych powierzchni korzenia.
- Protokół podkreśla znaczenie struktury powierzchni w badaniach nad oddziaływaniami korzeń-środowisko.
Cel badania
- Opracowanie syntetycznego systemu naśladującego mikrostrukturę powierzchni korzenia.
- Umożliwienie kontrolowanych badań nad oddziaływaniami między korzeniem a środowiskiem.
- Zapewnienie powtarzalnej techniki dla badaczy w dziedzinie biologii roślin.
Zastosowane metody
- Ekstrakcja korzeni roślin i przygotowanie form negatywowych.
- Wykorzystanie dimetakrylanu diuretanu i metakrylanu etylu do tworzenia replik negatywowych.
- Przygotowanie replik pozytywowych przy użyciu PDMS i etylocelulozy.
- Demonstracje wizualne ułatwiające powtórzenie procedury.
Główne wyniki
- Pomyślne wytworzenie odlewów negatywowych i pozytywowych powierzchni korzenia.
- Odlewy dokładnie odwzorowują strukturę komórkową oraz rozmieszczenie włośników korzeniowych.
- Wykazano możliwość zastosowania różnych materiałów do powielania powierzchni.
- Uzyskano wgląd w siły fizyczne wpływające na oddziaływania między korzeniem a środowiskiem.
Wnioski
- Technika ta otwiera nowe możliwości badań nad oddziaływaniami na powierzchni korzeni.
- Umożliwia ona szczegółowe badanie wpływu mikrostruktury na zachowanie korzeni.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tym protokole w celu analizy różnych czynników środowiskowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta biomimetyczna platforma umożliwia kontrolowane badanie wpływu mikrostruktury powierzchni korzenia na oddziaływania mikrobiologiczne, wypełniając tym samym krytyczną lukę w badaniach nad interakcjami roślin i drobnoustrojów. Poprzez odwzorowanie delikatnej architektury włośników korzeniowych w materiałach syntetycznych, metoda ta pozwala na mechanistyczną weryfikację hipotez dotyczących biologicznych procesów zapośredniczonych przez powierzchnię. Podejście to zapewnia skalowalny i wielokrotnego użytku system do oceny, w jaki sposób fizyczne cechy powierzchni wpływają na kolonizację mikrobiologiczną i sekrecję enzymów w procesach badawczych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie zależności między strukturą a funkcją w interakcjach korzeń-mikroorganizmy poprzez wyizolowanie topografii powierzchni jako niezależnej zmiennej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalne powierzchnie syntetyczne do spójnego testowania hipotez w powtórzeniach eksperymentalnych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia generowanie mierzalnych matryc mikrostrukturalnych do zestandaryzowanej oceny adhezji drobnoustrojów i aktywności enzymatycznej.
- Wartość operacyjna: Wspiera wszechstronność materiałową (PDMS, etyloceluloza), co pozwala na dostosowanie właściwości powierzchni do konkretnych celów przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Ułatwia śledzenie lokalizacji mikroorganizmów względem określonych cech powierzchni, co umożliwia korelację mikrostruktury z efektami funkcjonalnymi, takimi jak sekrecja celulazy.
- Wartość operacyjna: Oferuje opcję zastosowania ulegającej degradacji etylocelulozy w celu modelowania dynamicznych zmian powierzchni w przedklinicznych badaniach nad wyzwaniem mikrobiologicznym.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta znajduje zastosowanie na etapie biologii odkrywczej, umożliwiając formułowanie hipotez dotyczących zachowań drobnoustrojów zapośredniczonych przez powierzchnię przed rozpoczęciem przesiewania związków lub optymalizacji wiodących struktur.
- Biologia odkrywcza: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez umożliwienie systematycznej zmienności gęstości włośników korzeniowych i cech strefy elongacji w celu przetestowania ich wpływu na zachowanie drobnoustrojów.
- Przesiewanie: Pozwala na wytwarzanie standaryzowanych, powtarzalnych powierzchni do wysokiej wierności oceny interakcji mikrobiologicznych w kontrolowanych warunkach powierzchniowych.
- Analityka: Umożliwia mapowanie przestrzenne lokalizacji mikroorganizmów względem mikrostruktury powierzchni, zapewniając ilościowe odczyty oparte na obrazowaniu dla badań nad interakcjami.
- Badania translacyjne: Łączy analizę mikrostruktury w fazie odkrywczej z walidacją przedkliniczną za pomocą powierzchni biomimetycznych odzwierciedlających naturalną architekturę korzenia.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy technologię platformową możliwą do zastosowania w wielu gatunkach roślin i systemach mikrobiologicznych, co redukuje nadmiarowość w opracowywaniu modeli.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad interakcjami korzeń-mikrob poprzez oddzielenie struktury powierzchni od zmiennych chemicznych i biologicznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki zestandaryzowanym protokołom formowania i replikacji, kompatybilnym ze standardowym wyposażeniem laboratoryjnym.
- Wartość strategiczna: Zwiększa pewność podejmowania decyzji typu go/no-go poprzez dostarczanie predykcyjnych modeli powierzchni, co zmniejsza zależność od zmiennych próbek naturalnych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów mikrobiologicznych lub związków z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o profile interakcji zależne od struktury.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu obchodzenia się z tkankami roślinnymi oraz techniki miękkiej litografii w celu pomyślnego wykonania formy.
- Niezbędny jest sprzęt do utwardzania promieniami UV oraz desykator próżniowy do produkcji replik pozbawionych pęcherzyków powietrza.
- Wymagane są zestandaryzowane protokoły przygotowania korzeni, aby zapewnić spójne odwzorowanie mikrostruktury w różnych partiach.
- Wybór materiałów wiąże się z kompromisem między trwałością PDMS a biodegradowalnością etylocelulozy, w zależności od celów badania.
- Ograniczeniem jest konieczność delikatnego wyjmowania korzeni, aby zachować subtelne struktury włośników podczas tworzenia formy negatywowej.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:51
Root Preparation
1:37
Preparation of the Root Negative Replica from Polyurethane
2:47
Preparation of the Root Positive Replica from PDMS and Ethyl Cellulose
4:05
Results: Microscopy Images of Negative and Positive Replica
5:14
Conclusion
