Analiza sieci α-aktininy w ludzkich kardiomiocytach pochodzących z iPSC przy użyciu mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek
3 listopada 2020
Tworzenie właściwej sieci sarkomerowej jest ważne dla dojrzewania kardiomiocytów pochodzących z iPSC. Przedstawiamy podejście oparte na super rozdzielczości, które pozwala na ilościową ocenę strukturalnego dojrzewania kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, w celu poprawy warunków hodowli sprzyjających rozwojowi serca.
Metoda ta może być stosowana do ilościowej oceny dojrzewania sarkomeru w kardiomiocytach pochodzących z iPSC. Korzystając z tego podejścia opartego na super rozdzielczości, możliwe jest wykrycie nawet subtelnych zmian w organizacji sarkomerów, co nie jest możliwe w przypadku konwencjonalnego obrazowania konfokalnego. Co najmniej trzy godziny przed użyciem włączyć mikroskop i doprowadzić próbkę do temperatury pokojowej.
Gdy mikroskop jest gotowy, dodaj 300 mikrolitrów buforu do obrazowania PALM do studzienki z oznakowanymi komórkami i włóż szkiełko komory do uchwytu stolika mikroskopu. Wybierz obiektyw olejowy 1.57 NA 100X i użyj trybu PALM w oprogramowaniu do obrazowania, a następnie aktywuj ustawienia TIRF. Ustaw liczbę klatek na 5 000 do 10 000, moc lasera UV na 0,1%, a laser 647 na 0,2%, a poziom wzmocnienia na 50 do 100.
Po ustawieniu wszystkich parametrów akwizycji włącz oświetlenie laserowe i wybierz komórkę docelową. Aby uzyskać obraz, zwiększ moc lasera 647 do 100% i zmniejsz wzmocnienie do zera. Wybielaj komórkę docelową przez około pięć sekund, a następnie zwiększ wzmocnienie do 50 i rozpocznij akwizycję obrazu PALM.
Aby zrekonstruować dane PALM, po zakończeniu akwizycji otwórz dane w ImageJ i otwórz wtyczkę Thunderstorm. Wybierz opcję uruchom analizę we wtyczce i otwórz menu ustawień kamery. Wprowadź rozmiar piksela i wzmocnienie elektromagnetyczne.
W menu analizy przebiegu ustaw kolejność B-splajn na trzy, skalę B-splajn na dwa, próg intensywności szczytowej na stfwave. f1, promień dopasowania na trzy, początkową sigma na 1,6, powiększenie na pięć, częstotliwość aktualizacji na 50, a następnie kliknij przycisk OK. Po rekonstrukcji wybierz sigma w menu histogramu wykresu i użyj narzędzia prostokąt, aby wybrać interesujący Cię obszar, wykluczając możliwe artefakty. Dodaj obszar zainteresowania do filtru i dodaj wartość niepewności mniejszą niż 25 do wartości obszaru zainteresowania.
Na karcie usuń duplikaty wprowadź próg odległości wynoszący 10 nanometrów. Na karcie scalania ustaw maksymalną odległość na 20, maksymalną liczbę ramek na cząsteczkę na zero, a maksymalną liczbę ramek poza cząsteczką na jedną. W zakładce korekcji dryftu wybierz korelację krzyżową i ustaw liczbę przedziałów oraz powiększenie na pięć, a następnie zapisz końcowy obraz PALM i wyeksportuj dane końcowe
.Aby przeanalizować długość sarkomeru, zaimportuj zrekonstruowany obraz PALM do ImageJ i użyj narzędzia linii, aby narysować linię między wybranymi strukturami sarkomeru prostopadłą do dysku Z, aby zmierzyć najkrótszą odległość między włóknami aktyny. W menu analizy wybierz profil działki i uzyskaj długość między dwoma szczytami. Aby przeanalizować grubość dysku Z, przekonwertuj zrekonstruowany obraz PALM na obraz w trybie ośmiobitowym i otwórz wtyczkę Ridge Detection.
Ustaw szerokość linii na 20, wysoki kontrast na 230, niski kontrast na 10, sigma na 0,79, dolny próg na 25,84, a minimalną długość linii na 20. Wybierz opcję Szacowana szerokość, Wydłuż linię i Wyświetl wyniki, a następnie kliknij przycisk OK i użyj średniej szerokości linii z tabeli wyników do dalszej analizy. Kardiomiocyty i komórki noworodka pochodzące z iPSC wykazują podobny wzór alfa-aktyniny z nieregularnymi, nieuporządkowanymi strukturami sarkomerowymi.
Ocena ilościowa pokazuje, że długość i grubość włókien alfa aktyniny są prawie identyczne między dwiema grupami komórek, co wskazuje na przedwczesny stan rozwojowy kardiomiocytów pochodzących z iPSC. Natomiast dorosłe dojrzałe kardiomiocyty wykazują regularną sieć sarkomerów z nieznacznie zwiększoną długością sarkomeru i zmniejszoną grubością dysku Z. Porównanie konwencjonalnego obrazowania konfokalnego i PALM nie wykazało znaczącej różnicy w długości sarkomeru.
Jednak znacznie zmniejszona grubość dysku Z jest wykrywana, gdy kardiomiocyty iPSC są poddawane obrazowaniu PALM. Po zastosowaniu metody PALM obserwuje się wzrost rozdzielczości, który jest wspierany przez odpowiednie wykresy intensywności. Warto zauważyć, że struktury sarkomerowe uzyskane przy użyciu bufora niskiej jakości wydają się być grubsze w porównaniu ze strukturami uchwyconymi w optymalnych warunkach obrazowania.
Ten brak dokładności danych wynika ze zmniejszonych właściwości mrugania fluoroforu, co skutkuje mniejszą liczbą wykrytych fotonów na zdarzenie lokalizacyjne. Co więcej, precyzja lokalizacji jest zmniejszona, co obniża ogólną rozdzielczość zrekonstruowanego obrazu PALM. Ponadto dryft próbki może wpływać na precyzyjną lokalizację cząsteczek fluorescencyjnych, powodując rozmyte obrazy.
Aby uzyskać prawidłowe obrazy PALM, bardzo ważne jest, aby umożliwić równowagę termiczną całego systemu obrazowania, aby uniknąć nadmiernego dryfu próbki podczas obrazowania. Po tej procedurze inne struktury komórkowe, takie jak mitochondria, mogą być obrazowane za pomocą PALM w celu uzyskania dodatkowych parametrów dojrzewania kardiomiocytów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na dojrzewaniu sieci sarkomerów w kardiomiocytach pochodzących z iPSC, co ma kluczowe znaczenie dla rozwoju serca. Wprowadzono metodę obrazowania o wysokiej rozdzielczości (super-resolution) do ilościowej oceny struktury sarkomerów, co umożliwia wykrycie subtelnych zmian organizacyjnych, których nie można zidentyfikować za pomocą konwencjonalnych metod.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Dojrzewanie kardiomiocytów
- Modele komórkowe pochodzące z komórek macierzystych
- Mikroskopia superrozdzielcza
Wprowadzenie
- Tworzenie sarkomerów jest niezbędne dla funkcjonowania kardiomiocytów.
- Kardiomiocyty pochodzące z iPSC często wykazują cechy niedojrzałości w porównaniu z kardiomiocytami dorosłymi.
- Istniejące techniki obrazowania mogą nie oddawać w sposób wystarczający szczegółów strukturalnych.
Zastosowane metody
- Wykorzystano techniki obrazowania o superrozdzielczości, a konkretnie PALM.
- Jako biologiczny model systemowy posłużyły kardiomiocyty pochodzące z iPSC.
- Przetwarzanie i analiza obrazów zostały wykonane przy użyciu programu ImageJ oraz jego wtyczek.
Główne wyniki
- Obrazowanie PALM ujawniło szczegółowe różnice w długości sarkomerów i grubości dysków Z.
- Stan dojrzewania kardiomiocytów pochodzących z iPSC określono jako przedwczesny.
- Porównanie z kardiomiocytami dorosłymi wykazało ustrukturyzowaną sieć sarkomerów.
Wnioski
- Niniejsze badanie wykazuje skuteczność obrazowania o superrozdzielczości w ocenie rozwoju kardiomiocytów.
- Wyniki mają istotne znaczenie dla opracowywania usprawnionych warunków hodowli oraz oceny stanu zdrowia serca.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Ilościowa ocena organizacji sarkomerów w kardiomiocytach pochodzących z iPSC jest niezbędna dla rozwoju predykcyjnych modeli serca w procesach odkrywania leków i modelowania chorób. Mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek umożliwia wykrycie subtelnych różnic w dojrzewaniu strukturalnym, co bezpośrednio wpływa na wiarygodność przedklinicznych analiz kardiologicznych. Zdolność ta wspiera ciągłość translacyjną i zmniejsza ryzyko związane z wczesnym etapem walidacji celów kardiologicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia ilościową analizę dojrzewania sarkomerów jako funkcjonalnego biomarkera rozwoju kardiomiocytów.
- Wspiera mechanistyczną ocenę ryzyka poprzez rozróżnianie niedojrzałych od dojrzałych fenotypów serca z rozdzielczością nanometryczną.
- Zwiększa wiarygodność prognostyczną modeli kardiologicznych pochodnych z iPSC w procesach walidacji celów terapeutycznych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Ułatwia przygotowanie strukturalnie zwalidowanych systemów kardiomiocytów do późniejszego screeningu związków.
- Umożliwia powtarzalny, ilościowy pomiar długości sarkomerów oraz grubości linii Z w celu standaryzacji analizy.
- Wspiera uzyskiwanie obrazowania o wysokiej rozdzielczości, co pozwala ocenić gotowość analizy oraz skalowalność platformy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wskaźniki dojrzałości strukturalnej z fenotypami serca istotnymi dla danej choroby w celu opracowania biomarkerów translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość przejścia od modeli komórkowych na etapie odkryć do przedklinicznych badań walidacyjnych w kardiologii.
- Zmniejsza ryzyko biologiczne, umożliwiając wczesne wykrywanie deficytów dojrzewania w inżynieryjnych tkankach serca.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda obrazowania o superrozdzielczości wpisuje się w kontinuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, dostarczając ilościowych odczytów strukturalnych służących do kwalifikacji modeli serca.
- Biologia odkryć: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących dojrzewania kardiomiocytów oraz analizę szlaków składania sarkomerów.
- Przesiewy: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki obrazowania do rozwoju testów i oceny związków.
- Analityka: Zapewnia pomiary o wysokiej rozdzielczości długości sarkomerów i grubości dysków Z do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Łączy charakterystykę in vitro modeli serca z dopasowaniem przedklinicznych biomarkerów.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia reużywalny schemat obrazowania i analizy do oceny struktury serca w programach B+R.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w modelowych systemach kardiologicznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje protokoły obrazowania i zapewnia powtarzalność wyników ilościowych.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne kapitałowo rozwijanie zasobów kardiologicznych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację modeli kardiologicznych i kandydatów translacyjnych z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu mikroskopii o superrozdzielczości oraz ilościowej analizy obrazu.
- Wymagany jest dostęp do zaawansowanej aparatury obrazowej i oprogramowania analitycznego (np. ImageJ z wtyczkami).
- Niezbędna jest rygorystyczna standaryzacja warunków obrazowania i jakości buforów pomiędzy zespołami.
- Może być wymagana adaptacja parametrów obrazowania dla różnych modeli komórkowych lub tkankowych.
- Dokładność obrazowania jest wrażliwa na dryf próbki, skład buforu oraz wyrównanie termiczne.
Często zadawane pytania dotyczące Biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:27
Photoactivated Localization Microscopy (PALM) Image Acquisition Setup
1:27
PALM Image Acquisition
1:50
PALM Data Reconstruction
2:39
Reconstructed PALM Image Post Processing
3:34
Sarcomere Filament Analysis
4:41
Results: Representative Human Induced Pluripotent Stem Cell (iPSC)-Derived Cardiomyocyte alpha-Actinin Network Analysis
6:23
Conclusion
