Wysokoprzepustowe profilowanie metaboliczne w celu udoskonalenia modelu mikroalg

Technologia mikromacierzy fenotypowych jest skuteczną metodą wysokoprzepustową, która funkcjonalnie określa komórkową aktywność metaboliczną w odpowiedzi na szeroki wachlarz metabolitów wejściowych. Wykorzystanie w tej technologii jest mierzone w postaci oddychania komórkowego określonego przez stopień rozwoju koloru wytwarzanego przez redukcję NADH barwnika redoks na bazie tetrazolium. W niniejszej pracy przedstawimy zastosowanie fenotypowych testów mikromatrycowych w kontekście mikroalg z wykorzystaniem gatunku modelowego Chlamydomonas reinhardtii.

Celem tego badania jest ustalenie wiarygodnej metody charakteryzowania fenotypowania metabolicznego mikroglonów, która może być wykorzystana do rozszerzenia istniejących modeli sieci metabolicznej glonów lub pokierowania rekonstrukcją nowych modeli. Szczep Chlamydomonas reinhardtii CC-503 można uzyskać w centrum zasobów Chlamydomonas na University of Minnesota, USA. Hoduj komórki w świeżym pożywce z fosforanem tris-octanu do połowy fazy logarytmicznej.

Sprawdź komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że są w dobrym stanie i nie są zanieczyszczone. Obracaj kulturę przy sile 2000 G przez 10 minut. Odrzucić supernatant bez naruszania osadu.

Przygotuj świeżą pożywkę z kranu zawierającą 0,1% barwnika fioletu tetrazolowego D"Dodaj do pożywki różne antybiotyki, w tym tymerynę, ampicylinę i kanamycynę, aby zahamować rozwój bakterii. Podłoże tłuszczowe i ten krok należy pominąć w odżywkach, w zależności od każdego rodzaju płytki. Ponownie zawiesić granulki i świeże media z kranu do końcowego stężenia 1 miliona komórek na mililitr.

Użyj płytek do oznaczania związków chemicznych, takich jak źródła węgla, źródła azotu, płytki ze źródłami fosforu i siarki oraz źródła azotu peptydowego. Zaszczepić 100 mikrolitrów odpowiedniej pożywki samozawierającej się do każdej studzienki płytek esejowych. Upewnij się, że zduplikowałeś testy.

Należy zauważyć, że na tym etapie komórki powinny być testowane za pomocą barwienia Gram-ujemnego przed i po teście w celu monitorowania zanieczyszczenia bakteryjnego. Włóż płytki do oznaczania obszaru związków chemicznych do systemu czytnika mikropłytek. Inkubuj wszystkie płytki w temperaturze 30 stopni przez okres do siedmiu dni i zaprogramuj system czytnika mikropłytek tak, aby odczytywał zmianę koloru barwnika co 15 minut.

Ponieważ większość czytników mikropłytek nie zapewnia źródła ciągłego światła podczas inkubacji, glony powinny być w stanie przeprowadzić oddychanie heterotroficzne. Eksportuj surowe dane kinetyczne z czytnika mikropłytek jako pliki CSV, które następnie zostaną wykorzystane jako dane wejściowe do pakietu oprogramowania do mikromacierzy fenotypowych i naszego oprogramowania. Aby przeprowadzić analizę danych mikromacierzy fenotypowej, należy użyć pakietu oprogramowania OmniLog micro Erik OPM, który działa w środowisku oprogramowania R.

W R studio, graficznym interfejsie użytkownika dla języka R, zainstaluj pakiet OPM i jego zależności przy użyciu poleceń wyszczególnionych w manuskrypcie. Przejdź do katalogu zawierającego pliki CSV z danymi kinetycznymi i zaimportuj dane za pomocą funkcji odczytu OPM. Dane kinetyczne mogą być agregowane i dyskretyzowane za pomocą estymacji parametrów pref.

Korzystanie z funkcji wykresu XY umożliwia odwzorowanie pomiarów oddychania lub wzrostu w funkcji czasu dla 96-dołkowych płytek testowych. Dane można wizualizować jako mapę cieplną przy użyciu wykresu poziomu funkcji, aby umożliwić szybki przegląd porównawczy danych kinetycznych. Kolejnym krokiem jest identyfikacja reakcji i genów związanych z nowymi metabolitami.

W przypadku istnienia istniejącego modelu glonów, analiza danych z systemu mikromacierzy fenotypowych może być wykorzystana do udoskonalenia tego modelu. Poniżej przedstawiamy potok, który wykorzystaliśmy do udoskonalenia sieci metabolicznej w skali genomu dla modelu Chlamydomonas przy użyciu danych z mikromacierzy fenotypu. Gdy nowy związek jest pozytywny pod kątem użycia, odpowiednie profile reakcji związku są definiowane przy użyciu bazy wiedzy metabolicznej, podając powiązane numery prowizji enzymów.

Pierwszym krokiem jest przeszukanie Kegga i MetaCyca w celu zidentyfikowania numerów komisji enzymatycznych, EC, dla reakcji z wykorzystaniem metabolizowanych znalezionych w układach związków chemicznych. Następnie używamy zidentyfikowanych numerów EC jako podstawy wyszukiwania w wielu dostępnych zasobach adnotacji glonów, takich jak Joint Genome Institute, JGI, Phytozome i recenzowane publikacje. Reakcje i metabolity są dodawane do opartego na COBRA modelu sieci metabolicznej Chlamydomonas reinhardtii, iRC1080, w celu rozszerzenia i udoskonalenia modelu.

Jeśli nie zostaną znalezione dowody genetyczne na poparcie numeru EC, można przeprowadzić wyszukiwanie oparte na profilu, takie jak NCBI Position-Specific Iterative, NCBI PSI-BLAST, w celu zidentyfikowania genów kandydujących związanych z reakcją. Wyniki są następnie oceniane ręcznie. Osoby, które przeszły ten krok kontroli jakości z wartościami E mniejszymi niż 0,05 dla istotności dla wyszukiwania numerów EC, są następnie dodawane do modelu metrycznego.

Ostatnim krokiem tego protokołu jest dopracowanie modelu, ocena i porównanie modeli. Skorzystaj z najnowszego zestawu narzędzi COBRA w wersji 3.0 i platformy MATLAB, aby wykonać kroki w celu udoskonalenia modelu. Po zainstalowaniu zestawu narzędzi Cobra możesz pobrać model iRC1080.

Następnie w MATLAB pierwszą rzeczą do zrobienia jest przejście do folderu zawierającego model referencyjny, iRC1080. Dodaj zidentyfikowane reakcje wraz z powiązanymi z nimi genami do modelu metabolicznego, takiego jak iRC1080, za pomocą funkcji zestawu narzędzi Cobra. Dodaj reakcję i zmień asocjację genów.

Przejdź do katalogu zawierającego model iRC1080 i wykonaj polecenia, aby załadować model. Zmień jego nazwę i dodaj nową reakcję i związany z nią gen. W niektórych przypadkach, gdy metabolit nie jest wytwarzany wewnątrzkomórkowo, ale jest pobierany z pożywki, reakcje transportu nowych metabolitów muszą zostać dodane do modelu za pomocą funkcji reakcji dodawania/wymiany w celu wprowadzenia lub wyprowadzenia metabolitu do pożywki zewnątrzkomórkowej.

Przetestuj zachowanie nowego wyniku i modelu, na przykład iBD1106, przeprowadzając analizę bilansu strumienia, FBA, wykorzystując funkcję optymalizacji modelu CB w jasnych i ciemnych warunkach w celu maksymalizacji biomasy jako funkcji obiektu. Rozwiązanie FBA generuje między innymi trzy wektory: strumienie reakcji, ceny cienia metabolitów i obniżone koszty reakcji. W tym miejscu przedstawiono przykład, w którym model iRC1080 jest porównywany z jego udoskonaloną wersją, iBD1106, poprzez uzyskanie cen równoległych, które reprezentują wrażliwość obiektywnej funkcji biomasy na zmiany i metabolity uwzględniane w każdym modelu.

Tutaj pokazujemy wykresy XY oddychania i wykresy poziomu źródeł węgla i płytek do oznaczania źródeł azotu dla ślepej próby i CC-503 odpowiednio w kolorze turkusowym i fioletowym. W każdym dołku krzywe oddychania reprezentują konwersję barwnika przez redukcję w funkcji czasu. Podświetlony pik w panelu A reprezentuje wykrycie octanu jako jedynego źródła węgla z tej płytki, co jest zgodne z literaturą dotyczącą Chlamydomonas.

Porównanie liczby metabolitów zidentyfikowanych przy użyciu trzech różnych metod: iRC1080, który jest dobrze dobranym modelem metabolicznym Chlamydomonas, czasu przelotu chromatografii gazowej GC-TOF oraz eseju o mikromacierzy fenotypowej pokazuje, że tylko sześć metabolitów nakłada się na siebie między trzema zestawami, podczas gdy 149 było wspólnych dla iRC1080 i zestawu testów mikromacierzy fenotypowych. Pokazuje to, że chociaż każda technologia ma mocne strony w badaniach nad profilowaniem metabolicznym, zestaw testów mikromacierzy fenotypowych może być znaczącym źródłem nowych informacji metabolicznych. Uzyskane informacje posłużyły do rozbudowy i udoskonalenia modelu sieci metabolicznej iRC1080.

W tym miejscu porównujemy zawartość modelu iRC1080 i rozszerzonego modelu iBD1106, w tym liczbę reakcji, liczbę metabolitów i liczbę genów. Pokazujemy, że nasze udoskonalenie modelu dodało ponad 254 reakcje do nowej sieci wynikowej. Reakcje te dzielą się na aminokwasy, dipeptydy, tripeptydy i reakcje transportu.

Nowo zidentyfikowane metabolity wykorzystano do rozbudowy sieci metabolicznej i udoskonalenia istniejącego modelu metabolicznego Chlamydomonas reinhardtii. Testy mikromacierzy fenotypowych mogą być wykorzystywane do charakteryzowania fenotypów metabolicznych istniejących i nowo wyizolowanych szczepów. Ponadto protokół, który zastosowaliśmy w kontekście mikroalg, może pomóc w udoskonaleniu modeli metabolicznych innych gatunków.