Zastosowanie systemu RatWalker do analizy chodu w genetycznym modelu szczurzym choroby Parkinsona
18 stycznia 2021
Tutaj opisujemy system RatWalker, zbudowany przez przeprojektowanie aparatu MouseWalker, aby dostosować go do zwiększonych rozmiarów i wagi szczurów. System ten wykorzystuje sfrustrowane całkowite odbicie wewnętrzne (FTIR), szybkie przechwytywanie wideo i oprogramowanie do analizy w otwartym dostępie do śledzenia i ilościowego określania parametrów chodu.
Metoda ta umożliwia powtarzalne ilościowe określenie różnic w parametrach chodu. Parametry chodu można ocenić u swobodnie chodzących gryzoni, a technika ta nie opiera się na inwazyjnych krokach, takich jak zanurzanie stóp w tuszu. Procedurę zademonstruje Ben Lamberty.
Zacznij od umieszczenia domowej klatki na końcu chodnika przed rozpoczęciem każdego biegu, aby służyć jako pozytywna wskazówka dla szczura do przejścia przez chodnik. Wyłącz światła w pokoju. Włącz kamerę i rozpocznij nagrywanie na kilka sekund przed umieszczeniem szczura na platformie.
Po zainstalowaniu wybiegu umieść szczura na końcu chodnika, naprzeciwko klatki domowej i pozwól mu przejść przez chodnik w niewymuszony sposób. Zatrzymaj nagrywanie, gdy zwierzę dotrze do końca chodnika. Wyczyść chodnik za pomocą 70% etanolu i nierysującego ręcznika między biegami i po oddaniu moczu lub kału przez zwierzę.
Następnie pozwól etanolowi odparować przed wprowadzeniem kolejnego zwierzęcia. Przeprowadź szczury przez chodnik w sumie siedem razy w każdym okresie obserwacji, biorąc pierwsze trzy biegi, które zostaną uznane za pozytywne do analizy. Oceń bieg jako podanie, jeśli zwierzę wykona cztery lub więcej kolejnych kroków w kierunku klatki domowej bez przerwy spowodowanej pielęgnacją, pauzami lub błędnymi ruchami.
Analizę chodu przeprowadzono na samcach szczurów DKO typu dzikiego i z Parkinem w wieku dwóch miesięcy, aby ustalić, czy zastosowanie kinematycznej analizy chodu może ujawnić subtelne upośledzenia motoryczne przed pojawieniem się problemów z motoryką dużą. Pomimo zwiększonej masy szczurów DKO, nacisk stopy wywierany na powierzchnię do chodzenia pozostał niezmieniony. Po ocenie kilku parametrów chodu w funkcji prędkości chodu, stwierdzono, że prędkość chodzenia i długość kroku są podobne między szczurami typu dzikiego i DKO.
Różnica między szczurami typu dzikiego i DKO stała się widoczna w fazie postawy i czasie trwania zamachu przy niższych prędkościach chodzenia. Ułamek cyklu krokowego, w którym noga znajduje się w fazie podporu, był współczynnikiem obowiązku. Więcej czasu spędzono w fazie wymachu niż w fazie podporu, ponieważ współczynnik pracy zmniejszył się.
Co więcej, podczas gdy prędkość zamachu wzrastała wraz ze wzrostem prędkości u zwierząt typu dzikiego, korelacja była stępiona u szczurów DKO. Analiza chodu FTIR została również wykorzystana do stworzenia wykresów śladów fazowych postawy każdej nogi w stosunku do ciała u swobodnie chodzących szczurów. Porównując ułożenie łap, zaobserwowano istotne zmiany w AEP i PEP.
Kilka dodatkowych parametrów uległo znaczącym zmianom u szczurów DKO w porównaniu z typem dzikim. Prędkość zamachu zarówno lewej, jak i prawej kończyny tylnej została zwiększona u szczurów DKO, podczas gdy czas trwania zamachu zarówno lewej, jak i prawej kończyny tylnej został skrócony. Spójna konfiguracja sprzętu, w tym pozycja kamery w stosunku do RatWalker, jest ważna dla pomyślnego wdrożenia tego protokołu.
Po wykonaniu tego protokołu zwierzęta są dostępne dla wszelkich dodatkowych niezbędnych zachowań lub eksperymentalnych punktów końcowych. Na przykład zmiany chodu mogą być skorelowane ze zmianami histologicznymi. Technika ta może być stosowana do oceny chodu w innych modelach gryzoni innych niż PD, takich jak modele lęku i depresji.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia system RatWalker, zaprojektowany do analizy chodu u swobodnie poruszających się szczurów z wykorzystaniem frustrowanego całkowitego wewnętrznego odbicia (FTIR) oraz szybkich nagrań wideo. Umożliwia on precyzyjną kwantyfikację parametrów chodu, dostarczając informacji o zaburzeniach ruchowych, w szczególności u genetycznie zmodyfikowanych szczurów Parkin DKO.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Analiza behawioralna
- Ocena chodu
Wstęp
- Analiza chodu u gryzoni zazwyczaj opiera się na metodach inwazyjnych.
- Poprzednie badania wykazały potrzebę opracowania lepszych technik nieinwazyjnych do oceny funkcji motorycznych.
- RatWalker jest modyfikacją systemu MouseWalker, dostosowaną do większych gryzoni.
- System ten może pomóc w zidentyfikowaniu subtelnych deficytów motorycznych przed wystąpieniem oczywistych objawów.
Cel badania
- Opracowanie nieinwazyjnej metody analizy chodu u szczurów.
- Zbadanie różnic w chodu szczurów typu dzikiego w porównaniu do szczurów Parkin DKO.
- Ustanowienie wiarygodnego protokołu śledzenia parametrów chodu w wielu próbach.
Zastosowane metody
- Do analizy chodu swobodnie poruszających się szczurów wykorzystano system RatWalker.
- Modelami biologicznymi były dwumiesięczne samce szczurów typu dzikiego oraz szczurów z podwójnym nokautem genu Parkin (DKO).
- W badaniu nie wspomiano o przepływach pracy multiomicznych.
- Szczury przeszły przez bieżnię łącznie siedem razy, a punktację oparto na kolejnych krokach.
- Parametry chodu ilościowo określono za pomocą spektroskopii FTIR i analizy wideo.
Główne wyniki
- Analiza chodu wykazała istotne różnice w fazie podparcia oraz czasie trwania fazy przenoszenia u szczurów DKO przy niższych prędkościach.
- Pomimo podobnej prędkości chodu, szczury DKO wykazywały zmienione czasowe parametry chodu w porównaniu ze szczurami typu dzikiego.
- U szczurów DKO zaobserwowano istotne zmiany w ułożeniu łap oraz prędkościach fazy przenoszenia.
- Badanie podkreśla znaczenie spójności sprzętu dla uzyskania wiarygodnych wyników.
Wnioski
- System RatWalker umożliwia nieinwazyjną analizę chodu z potencjałem do szerszych zastosowań w różnych modelach gryzoni.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia dysfunkcji motorycznych w genetycznych modelach chorób.
- Wnioski mają znaczenie dla badania zaburzeń chodu związanych z różnymi schorzeniami neurologicznymi.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wczesne wykrywanie subtelnych zaburzeń motorycznych w modelach genetycznych wspomaga walidację celów oraz minimalizację ryzyka mechanistycznego w programach badawczych nad chorobami neurodegeneracyjnymi. System RatWalker umożliwia nieinwazyjną, ilościową analizę chodu, która pozwala zidentyfikować zmiany fenotypowe przed wystąpieniem wyraźnych deficytów motorycznych, co zwiększa pewność prognostyczną w badaniach przesiewowych na etapie przedklinicznym. Podejście to pomaga w priorytetyzacji kandydatów terapeutycznych poprzez dostarczenie przekładalnych biomarkerów spadku funkcji w modelach choroby Parkinsona.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościową ocenę parametrów chodu w genetycznych modelach szczurzych choroby Parkinsona.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez powtarzalną ocenę funkcji motorycznych u swobodnie poruszających się gryzoni.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia wczesną charakterystykę fenotypową w celu zwiększenia pewności co do celu terapeutycznego oraz wspiera decyzje dotyczące selekcji projektów w portfelu badawczym.
Przesiew i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych, wysokorozdzielczych danych dotyczących chodu, w tym fazy podparcia, czasu trwania fazy przeniesienia oraz ułożenia łap, co umożliwia przeprowadzenie analizy porównawczej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, skalowalne odczyty odpowiednie do opracowywania testów oraz kampanii przesiewowych związków chemicznych.
- Powtarzalność: Wymaga spójnej konfiguracji sprzętu i kryteriów oceny w celu zapewnienia wiarygodności danych pomiędzy poszczególnymi próbami i laboratoriami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Koreluje zmiany w chodu z punktami końcowymi badania histologicznego, aby powiązać wyniki behawioralne z neuropatologicznymi.
- System istotny dla choroby: Modeluje wczesną dysfunkcję motoryczną w genetycznej chorobie Parkinsona przed wystąpieniem jawnych objawów.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Identyfikuje biomarkery oparte na chodu, które odzwierciedlają podstawową neuropatologię w modelach z niedoborem Parkin/Pink1.
Integracja potoku i przepływu pracy
System RatWalker wpisuje się w kontinuum procesu badawczego, od walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po przedkliniczne testy skuteczności, umożliwiając iteracyjną ocenę fenotypów motorycznych na różnych etapach badania.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez pomiar deficytów chodu w modelach genetycznych w celu potwierdzenia oddziaływania na cel oraz modulacji szlaków sygnałowych.
- Przesiewy: Dostarcza gotowych do analizy, ilościowych wyników służących do oceny efektów terapeutycznych w zakresie funkcji motorycznych w modelach gryzoni.
- Analityka: Dostarcza parametrów kinematycznych, takich jak współczynnik obciążenia (duty factor), prędkość wymachu i symetria kroku, umożliwiając obiektywne porównanie między genotypami.
- Badania translacyjne: Umożliwia korelację zmian w chodzie z markerami neurodegeneracji w celu wsparcia dopasowania biomarkerów i uzyskania wglądu w patofizjologię.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Stanowi skalowalną, nieinwazyjną platformę możliwą do zastosowania w wielu modelach chorób neurologicznych poza chorobą Parkinsona.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez wykrywanie wczesnych zaburzeń motorycznych, które odzwierciedlają kliniczne objawy prodromalne.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki standaryzowanemu pokonywaniu ścieżki, progom punktowym oraz kontroli środowiskowej.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje go/no-go poprzez zmniejszenie zależności od odczytów fenotypowych na późnym etapie rozwoju przedklinicznem.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia postęp z uwzględnieniem ryzyka poprzez identyfikację modeli z trafnością teoretyczną do przesiewu terapeutycznego.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy z zakresu neuronauki behawioralnej oraz analizy ruchu w oparciu o wideo w celu prawidłowej konfiguracji i interpretacji.
- Zależy od stałego ustawienia kamery, warunków oświetlenia oraz czystości ścieżki w celu zminimalizowania zmienności.
- Wymaga uzgodnienia kryteriów oceny przebiegów pomiędzy członkami zespołu (np. cztery kolejne kroki), aby zapewnić porównywalność danych.
- Należy uwzględnić specyficzne dla gatunku wzorce lokomocji podczas adaptacji systemu do innych modeli lub szczepów gryzoni.
- Ogranicza się do oceny czasowych i przestrzennych parametrów chodu; nie rejestruje złożonych sekwencji lokomocyjnych ani precyzyjnej kinematyki kończyn bez zastosowania metod uzupełniających.
