Udoskonalone oczyszczanie tkanek oparte na technologii CLARITY w celu trójwymiarowej organizacji fibroblastów w zdrowych i uszkodzonych sercach myszy
16 maja 2021
Opracowano udoskonaloną metodę oczyszczania tkanek i zastosowano ją do serca dorosłej myszy. Metoda ta została zaprojektowana w celu usunięcia gęstej, autofluorescencyjnej tkanki serca, przy jednoczesnym zachowaniu znakowanej fluorescencji fibroblastów przypisywanej genetycznej strategii reporterowej.
Ten nowatorski protokół oczyszczania tkanek ulepsza istniejącą technologię, aby umożliwić dokładniejsze przyjrzenie się in vivo określonym typom komórek w sercu i ich zachowaniu w warunkach urazu. Ten protokół jest szybki i dość prosty. Pozwala na utrzymanie fluorescencji marca przy minimalnej interferencji z autofluorescencją tkanek tła bez konieczności barwienia komórek lub tkanek.
Zacznij od użycia gazika nasączonego 70% etanolem, aby oczyścić brzuszną powierzchnię eksperymentalnej myszy. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać trzycentymetrowe nacięcie poprzeczne, około trzy metry poniżej wyrostka mieczykowatego i oddeglove myszy od brzucha do wyrostka mieczykowatego, aby oddzielić skórę od leżącej poniżej tkanki ściany brzucha. Wykonaj dwucentymetrowe poprzeczne nacięcie w podskórnej tkance ściany brzucha, trzy centymetry poniżej wyrostka mieczykowatego i wykonaj pionowe cięcie od tego nacięcia w górę linii środkowej przez klatkę piersiową.
Przypnij klatkę piersiową z powrotem, aby odsłonić serce. I użyj 10-mililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 27, aby wstrzyknąć zimny PBS do żyły głównej górnej i aorty. Kiedy cała krew zostanie wypłukana z serca, podaj 10 mililitrów zimnego 4% PFA do żyły głównej górnej i aorty, aby rozpocząć proces utrwalania.
Kiedy cały utrwalacz zostanie rozbłyskany, wytnij serce i użyj skalpela z prostym ostrzem, aby oddzielić przedsionki, prawą komorę i przegrodę oraz lewą komorę. Umieść serce w 15-mililitrowej stożkowej probówce z zimnym 4% PFA na nocną inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza na nutatorze. Następnego ranka dodaj 0,25% roztwór fotoinicjatora do świeżo przygotowanego roztworu hydrożeli i przenieś serce do hydrożelu.
Zawiń stożkową probówkę w folię na noc inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza bez zakłóceń fizycznych. Następnego ranka podgrzej probówkę w kąpieli perełkowej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 2,5 godziny, a następnie użyj kleszczy, aby ostrożnie przenieść serce do 15-mililitrowej probówki PBS. Umyj serce trzy razy w PBS przez jedną godzinę na pranie w temperaturze 37 stopni Celsjusza na nutatorze i przenieś serce do kosza aktywnej maszyny do elektroforezy.
Zabezpiecz pokrywę na miejscu i napełnij zbiornik komory aktywnej elektroforezy roztworem czyszczącym do elektroforezy. Gdy komora jest pełna, zanurz kosz w roztworze i dokręć nakrętkę urządzenia do elektroforezy. Następnie uruchom maszynę do elektroforezy przy 1,5 ampera i 37 stopniach Celsjusza na 1,5 godziny.
Po elektroforezie sprawdź wzrokowo serce, aby upewnić się, że nie pozostała żadna nieprzezroczysta tkanka. Umyj oczyszczone serce trzy razy w 15-mililitrowym dwa przez godzinę w świeżym PBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza na pranie na nutatorze. Przed zanurzeniem serca w środku odbarwiającym w celu zmniejszenia autofluorescencji hemu.
Po 48 godzinach umyj serce trzykrotnie w PBS, jak pokazano, i wyrównaj serce w świeżo przygotowanym RIMS przez 48 godzin przed obrazowaniem. Aby obrazować 3D oczyszczone serce, najpierw umieść cienką warstwę smaru próżniowego na dnie wydrukowanego w 3D dolnego zbiornika, o tej samej wysokości, co próbka, która jest obrazowana. Napełnij zbiornik RIMS i użyj końcówki pipety, aby usunąć wszelkie pęcherzyki.
Ostrożnie umieść serce w RIMS lewą ścianą komory skierowaną do góry, uważając, aby do roztworu nie dostały się pęcherzyki. Użyj smaru próżniowego, aby przymocować szklane szkiełko nakrywkowe do dolnej powierzchni wydrukowanego w 3D górnego elementu zbiornika i umieść szkiełko nakrywkowe górnego zbiornika na dolnych zbiornikach, uważając, aby uniknąć pęcherzyków. Następnie napełnij górne zbiorniki glicerolem.
Użyj mikroskopu konfokalnego, aby zobrazować oczyszczone serca. Połączenie wyrafinowanego oczyszczania tkanki serca z obrazowaniem 3D umożliwia zaawansowaną, szczegółową wizualizację fibroblastów serca. Korzystając z tej techniki obrazowania, obserwuje się, że fibroblasty są gęsto upakowane i mają wrzecionowatą morfologię w nieuszkodzonych sercach.
Po urazie reperfuzyjnym niedokrwiennym obserwuje się utratę fibroblastów serca w okolicy niedokrwiennej przez pierwsze trzy dni po urazie. Do siódmego i czternastego dnia fibroblasty migrują lub namnażają się, aby ponownie zasiedlić uszkodzony obszar tkanki. W 28 dniu populacja fibroblastów serca otaczających uszkodzone obszary serca osiąga największą gęstość.
Półtora dnia po uszkodzeniu zawału mięśnia sercowego w uszkodzonej lewej komorze pozostaje niewiele fibroblastów. Jednak w trzecim dniu fibroblasty rozszerzają się i są obecne w większości lewej komory. W przeciwieństwie do chirurgii niedokrwiennej, wlew angiotensyny drugiej i fenolefryny przez kilka tygodni nie powoduje utraty tkanki serca i ścieńczenia ścian.
Zamiast tego fibroblasty wyrównują się wzdłuż osi wzorca skurczu spirali prawoskrętnej, co widać podczas korzystania z protokołu oczyszczania tkanek rafinowanych. Ponadto, po leczeniu angiotensyną drugą i fenolefryną, fibroblasty wydają się małe i zaokrąglone, w przeciwieństwie do kształtu wrzeciona obserwowanego w modelach rozrostu niedokrwiennego i uszkodzenia zawału mięśnia sercowego. Oczyszczanie elektroforetyczne należy wykonywać ostrożnie, zwłaszcza podczas pracy z sercami, które przeszły protokoły urazów.
Protokół ten można wykorzystać do oceny, jak fibroblasty serca reagują na uraz in vivo. Różne markery fluorescencyjne mogą być również wykorzystane do zrozumienia, w jaki sposób serce reaguje na uraz na poziomie komórkowym.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Opracowano ulepszoną metodę przejaśniania tkanek dla serca dorosłej myszy, która umożliwia wizualizację specyficznych typów komórek przy jednoczesnym zminimalizowaniu tła autofluorescencyjnego. Niniejszy protokół usprawnia istniejące techniki badania tkanki serca.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia układu sercowo-naczyniowego
- Inżynieria tkankowa
Wstęp
- Techniki przejaśniania tkanek są niezbędne do obrazowania gęstych tkanek biologicznych.
- Autofluorescencja może maskować specyficzne sygnały komórkowe w badaniach obrazowych.
- Zachowanie fluorescencji znakowanych komórek jest kluczowe dla dokładnej analizy.
- Istniejące metody mogą wymagać barwienia, co komplikuje cały proces.
Cel badania
- Opracowanie szybkiego i prostego protokołu przejaśniania tkanek.
- Poprawa wizualizacji fluorescencji fibroblastów w tkance serca.
- Zmniejszenie zakłóceń tła pochodzących z autofluorescencji.
Zastosowane metody
- Do oczyszczenia brzusznej powierzchni myszy wykorzystano 70% etanol.
- Wykonano nacięcia chirurgiczne w celu uzyskania dostępu do serca.
- Zastosowano nowy protokół klarowania w odniesieniu do tkanki serca.
- Zachowano fluorescencję markerów bez konieczności barwienia.
Główne wyniki
- Nowy protokół skutecznie oczyścił gęstą tkankę serca.
- Fluorescencja fibroblastów została zachowana podczas procesu.
- Autofluorescencja tła została znacząco zredukowana.
- Metoda ta umożliwia lepsze obrazowanie komórek serca in vivo.
Wnioski
- Ta udoskonalona metoda usprawnia badanie tkanki serca.
- Stanowi ona cenne narzędzie dla naukowców badających reakcje na uszkodzenia serca.
- Protokół jest wydajny i minimalizuje potrzebę stosowania dodatkowych barwień.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zrozumienie dynamiki fibroblastów serca w trzech wymiarach dostarcza kluczowych informacji na temat mechanizmów włóknienia, które prowadzą do zwiększenia sztywności komórby i progresji niewydolności serca. Ta udoskonalona metoda klarowania tkanek oparta na technice CLARITY umożliwia wysokowierną wizualizację zachowania fibroblastów w całym organie, bez ograniczeń wynikających z penetracji przeciwciał czy utraty fluorescencji, co wspiera minimalizowanie ryzyka mechanistycznego podczas walidacji celów terapeutycznych w chorobach układu sercowo-naczyniowego. Metoda ta posiada wartość prognostyczną, ujawniając rozdzielczo przestrzennie odpowiedzi fibroblastów na modele uszkodzeń niedokrwiennych i niedokrwiennych, co pozwala na podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) we wczesnych etapach procesów odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie lokalizacji i morfologii fibroblastów w nienaruszonym tkance w celu wyjaśnienia ról patogennych w przeciwieństwie do naprawczych w zwłóknieniu mięśnia sercowego.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez powiązanie genetycznego znakowania fibroblastów (Tcf21-MerCreMer; Rosa26-loxP-eGFP) z fenotypami przestrzennymi w zdrowych i uszkodzonych sercach.
- Pewność prognostyczna: Ujawnia specyficzne dla urazu wzorce fibroblastów — takie jak uporządkowane pasma po podaniu angiotensyny II/fenylefryny lub repopulację ze strefy brzeżnej po niedokrwieniu — co pozwala zredukować ryzyko błędnych hipotez mechanistycznych.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Pozwala na uzyskanie oczyszczonych, znakowanych fluorescencyjnie serc kompatybilnych z obrazowaniem konfokalnym w celu ilościowej analizy 3D gęstości, rozmieszczenia i morfologii fibroblastów.
- Powtarzalność: Standaryzowane oczyszczanie oparte na elektroforezie (1,5 A, 37°C, 1,5 godziny) oraz równoważenie RIMS zapewniają spójne właściwości optyczne tkanek we wszystkich grupach eksperymentalnych.
- Skalowalność: Kompatybilność z przetwarzaniem wielu próbek w aktywnych komorach elektroforetycznych umożliwia bezpośrednie porównanie modeli kontrolnych, niedokrwiennych i nadciśnieniowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- System istotny dla choroby: Rejestruje odpowiedzi fibroblastów w modelach naśladujących ludzkie niedokrwienie (reperfuzja) oraz przeciążenie ciśnieniowe (angiotensyna II/fenylefryna), co jest zgodne z klinicznymi fenotypami włóknienia.
- Ciągłość translacyjna: Śledzi śmierć fibroblastów, ponowną populację strefy przyrannej oraz szczyty gęstości w 28. dniu po niedokrwieniu — kluczowych oknach czasowych dla testowania interwencji antyfibrotycznych.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Rozróżnia profibrotyczne fibroblasty wrzecionowate w niedokrwieniu od małych, zaokrąglonych fenotypów w nadciśnieniu, co pozwala na modulację ścieżek specyficznych dla danego celu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania – od testowania hipotez dotyczących punktów uchwytu, po identyfikację związków wiodących – dostarczając danych fenotypowych z rozdzielczością przestrzenną, które łączą wyniki in vitro z efektami funkcjonalnymi w modelach przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących aktywacji, migracji i proliferacji fibroblastów w kontekście tkanki 3D, wyjaśniając wkład poszczególnych szlaków w proces włóknienia.
- Przesiewanie: Generuje ilościowe wyniki obrazowania (gęstość, orientacja i morfologia fibroblastów), które nadają się do analizy wysokoprzepustowej w kaskadach przesiewania związków.
- Analityka: Wspiera morfometryczną i przestrzenną analizę statystyczną sieci fibroblastów, umożliwiając porównania między różnymi genotypami, rodzajami urazów i punktami czasowymi.
- Badania translacyjne: Łączy dynamikę fibroblastów z ramami czasowymi przebudowy komór exemplarycznej komory, wspierając przedkliniczną walidację zgodną z markerami biologicznymi.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy powtarzalną platformę przejaśniania tkanek i obrazowania, którą można zastosować w wielu modelach chorób układu sercowo-naczyniowego i dla różnych typów komórek poza fibroblastami.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w funkcji fibroblastów poprzez zachowanie natywnej architektury tkankowej oraz integralności sygnału fluorescencyjnego.
- Wartość operacyjna: Eliminuje konieczność sekcjonowania i barwienia, co zmniejsza zmienność procesu i zwiększa wydajność fenotypowania 3D.
- Wartość strategiczna: Zwiększa pewność decyzji go/no-go poprzez ujawnienie docelowych odpowiedzi fibroblastów, które pozwalają przewidzieć wyniki funkcjonalne w modelach niewydolności serca.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów antyfibrotycznych z uwzględnieniem ryzyka na podstawie przestrzennie zwalidowanego zaangażowania celu i modulacji fenotypowej.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie chirurgii serca myszy, fiksacji perfuzyjnej oraz technik przejrzyszczania tkanek opartych na hydrożelach.
- Zależne od dostępu do urządzeń do elektroforezy aktywnej, mikroskopii konfokalnej oraz roztworów montujących RIMS/glicerol.
- Wymaga standaryzacji czasu i temperatury przejrzyszczania, aby zapobiec nadmiernemu przejrzyszczeniu lub autofluorescencji w uszkodzonej tkance.
- Adaptacja do innych modeli chorobowych może wymagać optymalizacji czasu odbarwiania w celu redukcji tła pochodzącego z hemu bez wygaszania sygnału GFP.
- Ograniczenie praktyczne: Długoterminowa stabilność obrazowania zależy od prawidłowej równowagi RIMS, aby zapobiec niedopasowaniu współczynnika załamania światła i degradacji sygnału.
