Wykorzystanie zarodka kurzego jako potężnego narzędzia w ocenie kardiotoksyczności rozwojowej
21 marca 2021
Kurze zarodki, jako klasyczny model rozwojowy, są używane w naszym laboratorium do oceny kardiotoksyczności rozwojowej po ekspozycji na różne zanieczyszczenia środowiska. Metody ekspozycji i metody oceny morfologicznej/funkcjonalnej zostały opisane w niniejszym manuskrypcie.
Witam wszystkich. Nazywam się Qixiao Jiang i jestem profesorem nadzwyczajnym na Wydziale Toksykologii Szkoły Zdrowia Publicznego na Uniwersytecie Qingdao. W imieniu mojej grupy badawczej zamierzam przedstawić korzyści płynące z wykorzystania zarodka kurzego w procesie oceny naszej kardiotoksyczności.
Zarodek kurczaka to klasyczny model rozwojowy, który ma wiele zalet, takich jak łatwa manipulacja, wysoka dostępność, zamknięty niezależny system i tak dalej. Praca z wieloma zanieczyszczeniami środowiska, takimi jak fenolowy kwas garbnikowy. Spaliny z silników wysokoprężnych, szczególnie materia na nanorurkach węglowych.
W laboratorium opracowaliśmy wiele metod ekspozycji, ale w przypadku większych przypadków rutynowo przeprowadza się również oceny funkcjonalne. W tym filmie pokażę Wam szczegóły dotyczące metod ekspozycji i metod morfologicznej oceny funkcjonalnej. Jeśli jesteś zainteresowany, skontaktuj się z nami.
Dziękuję. Oto nasze metody ekspozycji, które mogę Ci przedstawić. Pierwszą metodą, którą zamierzam przedstawić, jest wstrzyknięcie komórki powietrznej, w której bezpośrednio wstrzykniesz do komórki powietrznej.
Oczyść powierzchnię jaj roztworem polijodku. Jest to dostępny w handlu roztwór polijodku, rozcieńczony wodą dejonizowaną w 1/5. A następnie suszę skorupkę jajka bibułą, bez szorowania.
Jest to ważne, ponieważ szorowanie spowoduje zerwanie powłoki warstwy ochronnej na zewnątrz skorupy. Oczyściłem wszystkie jajka w ciemnym pokoju i zaznacz komórkę powietrzną ołówkiem. Wyklucz jajka z pęknięciami na skorupce.
Wyklucz również jaja z komórkami powietrznymi z boku. Jeśli ma końcówkę, jest bardzo mało prawdopodobne, że wyklują się normalnie. Zdezynfekuj obszar komórki powietrznej, a także metalową sondę, 75% alkoholem.
Wytrzyj je do sucha, a następnie wywierć mały otwór w środku obszaru komórki powietrznej za pomocą sondy. Nie wkładaj sondy głęboko w komórkę powietrzną. Zamiast tego rozbij skorupę tylko końcówką sondy.
Jeśli otwór nadal nie jest wystarczająco duży, ponownie rozbij skorupę w pobliżu istniejącego otworu, aż będzie wystarczająco duża, aby umożliwić włożenie końcówki. Włóż końcówkę pipety do otworu tak, aby końcówka dotykała wewnętrznej membrany. Powoli wstrzykiwać mieszaninę i przytrzymać ją w tym miejscu przez co najmniej 10 sekund.
Ma to na celu umożliwienie pełnego dozowania dozowanego oleju. A następnie usuń końcówkę. Teraz uszczelnij otwór pędzlem i kroplą stopionej parafiny.
Uważaj, aby nie kapać stopionej parafiny na pamięć wewnętrzną. Po zamknięciu umieść jaja w inkubatorze, aż osiągną pożądane stadium embrionalne. Drugą, metodą, którą zamierzam przedstawić, jest mikroiniekcja.
Przede wszystkim jaja należy oczyścić i obchodzić się z nimi zgodnie z opisem w sekcji dotyczącej wtrysku powietrza. Ta procedura musi być wykonywana w wysterylizowanym kapturze. Wysterylizuj obszar komórek powietrznych i narzędzia acetonem.
Wywierć mały otwór w środku obszaru komórki powietrznej za pomocą metalowej sondy. Nie wkładaj sondy głęboko w komórkę powietrzną, ponieważ może to spowodować uszkodzenie pamięci wewnętrznej. Następnie użyj tego samego procesu, aby ostrożnie powiększyć otwór, aż średnica wyniesie około dwóch milimetrów.
Może to pozwolić na potwierdzenie proporcji pamięci wewnętrznej. Następnie załaduj roztwór do mikrowtryskiwacza i ostrożnie włóż igłę przez otwór do wewnętrznej membrany na łączną odległość około trzech milimetrów. Delikatnie dozować roztwór, a następnie wyjąć igłę.
Igła powinna być ustawiona jak najbardziej prostopadle. Cienko uszczelnij otwór małym kawałkiem taśmy. Całkowicie zakryj otwór, aby zapobiec odwodnieniu i śmierci zarodka podczas kolejnej inkubacji.
Trzecią metodą, którą zamierzam przedstawić, jest infuzja komórek powietrznych, w której wkraplacz zanieczyszczenie gazowe do komórki powietrznej. Oczyść jaja i obchodź się z nimi zgodnie z opisem w sekcji dotyczącej wstrzykiwania komórek powietrznych.
A potem możesz czytać z jaj aż do 17 dnia embrionalnego. Z jajami należy obchodzić się w 17 dniu embrionalnym, aby oznaczyć obszar komórek powietrznych. W 18 dniu embrionalnym wyjmij jaja z inkubatora, wysterylizuj obszar komórek powietrznych i narzędzia acetonem.
A następnie ostrożnie wywierć dwa małe otwory po dwóch stronach komórki powietrznej. Jeden z nich służy do wstrzykiwania gazu lub aerozolu. Drugi służy do rozszerzania naszego powietrza.
Dokładnie kontroluj wielkość otworów, tak aby bok otworu iniekcyjnego był wystarczający tylko do wprowadzenia igły cewnika, natomiast średnica otworu rozszerzającego się powinna być nieco większa. Około jednego milimetra średnicy. To jest worek na próbki, którego używamy do przechowywania docelowego gazu lub aerozolu.
Możesz zastąpić go dowolnym urządzeniem, którego używasz. Delikatnie wlej 10 ml gazu lub aerozolu do strzykawki. A następnie ostrożnie przymocuj strzykawkę do naszej igły cewnika za pomocą wewnętrznego pilota igły, aby była miękka.
Delikatnie wprowadzić igłę cewnika do otworu infuzyjnego. Gdy już się tam znajdzie, dociśnij igłę cewnika. Ma to na celu zminimalizowanie wycieku z miejsca wstrzyknięcia.
Drugi palec można umieścić wokół otworu wydalającego w celu potwierdzenia infuzji. Jeśli napar wykonasz delikatnie, przepływ powietrza z otworu wydalniczego powinien być łatwo wyczuwalny. To jest pierwotne powietrze w komórce powietrznej, które jest wydmuchiwane.
Po zakończeniu naparu należy natychmiast uszczelnić oba otwory. Te taśmy i jaja wracają do inkubatora. Mogę przedstawić nasz proces oceny punktów końcowych.
W pełni znieczulić zwierzęta pentobarbitalem 33 mg/kg. Wtrysk IP testowany przez otwarcia. Następnie umieść kurczaki na stole operacyjnym.
Wysterylizuj obszar brzucha i elektrody etanolem. Następnie wprowadź dwie elektrody igłowe z dwóch stron brzucha podciągle. Upewnij się, że igły nie wchodzą do jamy brzusznej, lekko unosząc skórę.
I włóż igłę stamtąd. Po włożeniu ostrożnie popchnąć igłę do przodu, aż dotrze do boku jamy klatki piersiowej. Upewnij się, że igła nie wchodzi głęboko w ciało ani nie wystaje ze skóry.
Następnie wykonaj pomiary za pomocą przyrządu elektrokardiograficznego. Można również korzystać z innych instrumentów seminaryjnych zdolnych do EKG. Jest to nasza druga metoda oceny punktu końcowego, która polega na mapowaniu dla Motrin.
Jest to przekrój serca na drodze HME. To jest prawa komora, którą będziemy mierzyć. Aby to zrobić, używamy dwóch linijek.
Linijka 1 i linijka 2. Teraz po prostu kopiujemy linijkę na ekran i zmieniamy jej rozmiar do odpowiedniego rozmiaru, a następnie obracamy. I przesuwamy go tak, aby dwa końce linii poziomej spoczywały na 2 końcach 3 ścian prawej komory.
A teraz mamy siedem linii pomiarowych, które przechodzą przez ścianę naszych trzech prawych komór. Teraz kopiujemy również linijkę pomocniczą do obrazu. Zmieniamy również nieco jego rozmiar, obracamy i zastępujemy, aby był umieszczony podobnie.
Ta pozioma linia biegnie równolegle do zewnętrznej ściany prawej komory. A prostopadła przechodziłaby przez punkt, w którym linie istoty białej linijki stykają się z wewnętrzną ścianą lub prawą komorą. A następnie wykonujemy kropki pomiarowe, aby można je było później zmierzyć za pomocą obrazu J. Powtarzamy ten proces 7 razy na próbkę, tak aby nasz reprezentatywny pomiar prawej komory.
Pokażę Ci podsumowanie obecnych wyników. Jest to wstrzyknięcie PFOA do komórki jajowej przed inkubacją i można zauważyć, że wraz ze wzrostem stężenia LPF w surowicy skutecznie wzrosło. Zgodnie z demonstracją, skutecznością mikroiniekcji.
Widać, że A to kontrola, a B to miejsce, w którym wstrzyknięto białko q wyrażające się w doskonałej fluorescencji. Widać silną fluorescencję. I to jest demonstracja skuteczności naparu z nabłonka.
Widać, że po infuzji zaobserwowano dramatyczne zmiany światłowodowe w tkance mięśnia sercowego. Porządku. Widać też, że odstępy R-R kurczaków wylęgowych wynoszą 0, 1 i 2 tygodnie. Znacząco zmieniło się to również po infuzji ze spalinami z silników Diesla.
Wskazując, że bierzesz pod uwagę to, tę metodę. Tutaj również widać, że skuteczność naparu z nabłonka w tym przykładzie. można zauważyć, że prawa komora serca skutecznie zwiększyła się po nasyceniu aerozolem ze spalinami z silników Diesla.
I oczywiście również tutaj używamy metod histomorfometrycznych. Po prostu pokazujemy ci. Jest to dość skuteczne. Porządku.
To są wszystkie metody, które zamierzam Ci przedstawić. Mam nadzieję, że ułatwi to innym ludziom pracę z zarodkiem kurzym jako potężnym narzędziem badawczym w toksykologii rozwojowej. Miłego dnia.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym badaniu wykorzystano zarodki kurczęt jako klasyczny model rozwojowy do oceny kardiotoksyczności wywołanej przez zanieczyszczenia środowiskowe. Manuskrypt szczegółowo opisuje metody ekspozycji oraz techniki oceny morfologicznej i funkcjonalnej zastosowane w badaniu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Toksykologia rozwojowa
- Zdrowie środowiskowe
- Ocena kardiotoksyczności
Wstęp
- Zarodki kurcząt są powszechnie wykorzystywane w biologii rozwoju.
- Zapewniają one kontrolowane środowisko do badania efektów toksykologicznych.
- Zanieczyszczenia środowiska mogą mieć istotny wpływ na rozwój serca.
- Zrozumienie tych efektów jest kluczowe dla zdrowia publicznego.
Cel badania
- Ocena efektów kardiotoksycznych różnych zanieczyszczeń środowiskowych.
- Ustanowienie wiarygodnych metod ekspozycji i oceny.
- Wkład w zrozumienie toksykologii rozwoju.
Zastosowane Metody
- Narażenie zarodków kurzych na zanieczyszczenia środowiskowe.
- Ocena zmian morfologicznych w strukturach serca.
- Ewaluacja funkcjonalna wydajności serca.
- Wykorzystanie uznanych protokołów do oceny toksykologicznej.
Główne wyniki
- Identyfikacja konkretnych zanieczyszczeń indukujących kardiotoksyczność.
- Wykazanie skuteczności metod oceny.
- Zrozumienie wpływu ekspozycji środowiskowej na rozwój.
- Ustanowienie zarodków kurzych jako wartościowego modelu dla przyszłych badań.
Wnioski
- Zarodki kurczęt są skuteczne w badaniu efektów kardiotoksycznych.
- Zanieczyszczenia środowiskowe stanowią zagrożenie dla rozwoju serca.
- Konieczne są dalsze badania w celu zbadania długofalowych skutków.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Model zarodka kurczaka stanowi fizjologicznie istotny i dostępny system do wczesnej oceny kardiotoksyczności rozwojowej, umożliwiając mechanistyczne ograniczanie ryzyka związanego z zanieczyszczeniami środowiska przed rozpoczęciem badań na ssakach. Dobrze zdefiniowana oś czasu rozwoju serca oraz podobieństwo strukturalne do serc ssaków wspierają wiarygodność predykcyjną w walidacji celów i analizie szlaków sygnałowych. Podejście to pomaga w priorytetyzacji związków do dalszych badań i redukuje odsetek niepowodzeń na późnych etapach profilowania bezpieczeństwa.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biopharmaceuticals
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez terapeutycznych związanych ze szlakami rozwoju serca oraz walidację funkcjonalną celów molekularnych.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez ocenę efektów kardiotoksycznych zanieczyszczeń, takich jak PFAS, pyły zawieszone, spaliny z silników Diesla oraz nanomateriały.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia selekcję projektów w portfolio dzięki ilościowym punktom końcowym, w tym elektrokardiografii, histomorfometrii i biomarkerom molekularnym.
Przesiewy i rozwój testów
- Gotowość do analizy: Ustanawia zestandaryzowane metody ekspozycji (wstrzykiwanie z komory powietrznej, mikrowstrzykiwanie, inhalacja z komory powietrznej) w celu zapewnienia powtarzalności przesiewowej analizy związków.
- Wyniki ilościowe: Generuje dane funkcjonalne (odcinki R-R pochodne z EKG) oraz morfometryczne (pomiary ścian komór), służące do podejmowania decyzji na etapie przejścia z fazy hit-to-lead.
- Skalowalność: Umożliwia czasową ekspozycję od 0. dnia embrionalnego do okresu przedkluenia, co wspiera badania zależności dawka-odpowiedź oraz badania okien podatności.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wykorzystanie zachowanego rozwoju czterojamowego serca do przeniesienia wyników na modele ssaków.
- Mechanistyczna redukcja ryzyka: Zastosowanie immunohistochemii, qRT-PCR i Western blottingu do oceny ścieżek molekularnych zmienionych przez ekspozycję na zanieczyszczenia.
- Postęp skorygowany o ryzyko: Podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w oparciu o strukturalne i funkcjonalne punkty końcowe serca.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, zapewniając model kręgowca do analizy mechanistycznej przed badaniami na gryzoniach, co zwiększa wartość prognostyczną w procesie identyfikacji wiodących związków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących szlaków toksyczności rozwojowej serca poprzez kontrolowaną ekspozycję na zanieczyszczenia.
- Przesiewy: Dostarcza gotowych do analizy systemów z odczytami funkcjonalnymi i strukturalnymi do oceny związków chemicznych.
- Analityka: Umożliwia ilościowe porównanie funkcji serca (ECG) i morfologii (histomorfometria) w różnych grupach badawczych.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia dotyczące rozwoju z walidacją przedkliniczną poprzez zachowane mechanizmy kardiogenne.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny różnych zanieczyszczeń środowiskowych w profilowaniu bezpieczeństwa rozwojowego.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w procesie kardiotoksyczności rozwojowej.
- Wartość operacyjna: Sprzyja standaryzacji i powtarzalności dzięki zdefiniowanym oknom ekspozycji i zwalidowanym punktom końcowym oceny.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną redukcję ryzyka w przypadku związków wykazujących toksyczność dla serca.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko dzięki translacyjnym danym dotyczącym toksyczności rozwojowej.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z embrionami, technik mikrowstrzykiwania oraz elektrofizjologii serca.
- Zależność od infrastruktury inkubacyjnej oraz zachowania procedur sterylnych podczas ekspozycji i oceny.
- Konieczność uzgodnienia między zespołami czasu ekspozycji, dawkowania i doboru punktów końcowych w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Konieczność uwzględnienia adaptacji ze względu na dostępność przeciwciał specyficznych dla gatunku w badaniach immunohistochemicznych.
- Ograniczenia wynikające z braku modelowania transportu przez łożysko, co może wpływać na ekstrapolację do niektórych scenariuszy ekspozycji matczynej.
