Szybki przebieg badań przesiewowych w celu identyfikacji potencjalnej terapii skojarzonej GBM przy użyciu komórek macierzystych glejaka pochodzącego od pacjenta
28 marca 2021
Komórki macierzyste glejaka (GSC) to niewielka część komórek nowotworowych, które odgrywają kluczową rolę w inicjacji nowotworu, angiogenezie i oporności na leki w glejaku (GBM), najbardziej rozpowszechnionym i wyniszczającym pierwotnym guzie mózgu. Obecność GSC sprawia, że GBM jest bardzo oporny na większość pojedynczych leków docelowych, dlatego potrzebne są wysokoprzepustowe metody badań przesiewowych w celu zidentyfikowania potencjalnie skutecznych terapii skojarzonych. Protokół opisuje prosty przebieg pracy, aby umo
Komórki macierzyste glejaka to subpopulacja komórek glejaka, które są zwykle oporne na chemioterapię i radioterapię. W tym artykule opisaliśmy metodę szybkiej identyfikacji terapii skojarzonych, ukierunkowanych na komórki macierzyste glejaka, a nie na zróżnicowane komórki glejaka. W porównaniu z innymi metodami, które mogą być pracochłonne i skomplikowane.
Protokół ten jest stosunkowo prosty i szybki, aby zidentyfikować potencjalne użyteczne kombinacje leków. Rozpocznij od pobrania komórek macierzystych glejaka lub GSC z pożywki hodowlanej i odwirowania ich w temperaturze 70 razy G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Po usunięciu supernatantu trawić komórki za pomocą akutazy przez cztery minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Za pomocą końcówki o pojemności 200 mikrolitrów kilkakrotnie pipetuj komórki, aby doszło do dysocjacji i ponownie zawiesić osad komórek. Dodaj GSC o gęstości 200 000 komórek w jednym mililitrze pożywki hodowlanej do każdej studzienki 12-dołkowej płytki hodowlanej i inkubuj je przez noc. Och następnego dnia dodaj 30 mikrolitrów supernatantu wirusa lucyferazy-eGFP do każdego dołka płytki.
Odwiruj komórki w temperaturze 1000 razy G przez dwie godziny, w temperaturze 25 stopni Celsjusza i inkubuj je przez noc. Następnego dnia należy wymienić pożywkę w studzienkach, zbierając GSC, odwirowując je, usuwając supernatant, ponownie umieszczając je w świeżej pożywce i ponownie platerując. Hoduj komórki przez kolejne 48 godzin.
Obserwuj płytkę pod mikroskopem fluorescencyjnym i potwierdź pojawienie się komórek GFP-dodatnich. Sortować i zbierać GSC o wysokiej fluorescencji za pomocą sortera przepływowego i dalej je hodować. Pokryj 96-dołkowe optyczne płytki dolne mieszaniną macierzy zewnątrzkomórkowej, taką jak matrigel, i inkubuj je przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Usuń nadmiar mieszaniny i delikatnie przepłucz płytki raz PBS, a następnie wysiew komórki XG387-Luc o gęstości 1000 komórek w 100 mikrolitrach pożywki hodowlanej i do każdej studzienki pokrytych płytek i hoduj je przez noc. Następnego dnia obserwuj komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić ich przyczepienie do płytki. Następnie przygotować 200-mikromolowy roztwór temozolomidu i dwa mikromolowe roztwory docelowych środków w pożywce hodowlanej.
W przypadku skojarzonych badań przesiewowych leków należy usunąć ślepą próbę i dodać pożywkę zawierającą 200 mikromolowy temozolomid lub dwa mikromolowe środki celowane, lub kombinację obu, do każdej studzienki w celu uzyskania trzech kontrprób technicznych na zabieg. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez trzy dni. Wykonaj zdjęcia bioluminescencji komórkowej w płytce za pomocą systemu obrazowania widmowego IVIS.
Korzystając z wbudowanego oprogramowania, utwórz wiele okrągłych obszarów obszaru zainteresowania i określ ilościowo bioluminescencję komórkową. Aby zidentyfikować potencjalnych kandydatów, którzy mogliby wzmocnić działanie przeciwglejakowe temozolomidu, przeanalizowano 20 docelowych selektywnych inhibitorów małocząsteczkowych za pomocą badań przesiewowych w skojarzeniu leków. Wartości indeksu wrażliwości 13 docelowych agentów były powyżej zera, a pięć z nich powyżej 0,1.
Wskaźnik wrażliwości dwóch głównych kandydatów na leki, UMI-77 i A 83-01, był wyższy niż 0,25, co sugeruje ich potencjał do synergii z temozolomidem. Skojarzone leczenie temozolomidem i UMI-77 oceniano za pomocą testu antyproliferacyjnego w matrycy miareczkowania sześć na sześć. Wartości indeksu kombinacji były mniejsze niż jeden.
Wysokie wartości pojedynczego czynnika były większe od zera dla większości kombinacji temozolomidu i UMI-77 w różnych stężeniach. Sugeruje to ogólną synergiczną interakcję temozolomidu i UMI-77 w GSC XG387 i XG328. Protokół ten może być również stosowany do znajdowania kombinacji leków przy użyciu przylegających komórek rakowych, po prostu usuwając etap powlekania płytki.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia usprawniony protokół szybkiej identyfikacji synergistycznych kombinacji leków celujących w komórki macierzyste glejaka (GSCs) w glejakach wielopostaciowych (GBM). Przepływ pracy wykorzystuje GSCs znakowane lucyferazą, płytki pokryte matrigelem oraz wysokoprzepustowy screening oparty na bioluminescencji w celu oceny skuteczności terapii skojarzonych, mając na celu przełamanie oporności GSCs na konwencjonalne metody leczenia.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia nowotworów
- Badania nad komórkami macierzystymi
- Odkrywanie leków
- Neuroonkologia
Wprowadzenie
- Komórki macierzyste glejaka stanowią subpopulację w obrębie guzów glejaka wielopostaciowego, przyczyniając się do inicjacji nowotworu, angiogenezy oraz oporności na terapię.
- GSCs wykazują wysoką oporność na monoterapie celowane, co sprawia, że konieczne jest opracowanie terapii skojarzonych.
- Tradycyjne metody przesiewowe leków w przypadku GSCs są często żmudne i złożone.
- Konieczne są szybkie i wydajne protokoły przesiewowe w celu zidentyfikowania skutecznych kombinacji leków przeciwko GSCs.
Cel badania
- Ustanowienie prostego i szybkiego schematu postępowania w celu przesiewania potencjalnych synergistycznych kombinacji leków celowanych w GSCs.
- Walidacja zdolności protokołu do identyfikacji kombinacji wzmacniających efekt przeciwwutrakowy standardowych terapii w leczeniu glejaków.
- Wykazanie możliwości zastosowania protokołu zarówno w przypadku GSCs, jak i przylegających komórek nowotworowych.
Zastosowane metody
- Izolacja i hodowla macierzystych komórek glejaka z ustalonych linii komórkowych.
- Transdukcja GSCs wirusem lucyferazy-eGFP w celu obrazowania bioluminescencyjnego.
- Sortowanie GFP-dodatnich GSCs z wykorzystaniem cytometrii przepływowej.
- Wysiew GSCs na płytki 96-dołkowe powlekane matrigelem do przesiewania leków.
- Traktowanie temozolomidem, lekami celowanymi lub ich kombinacjami w powtórzeniach technicznych.
- Kwantyfikacja bioluminescencji komórkowej przy użyciu systemu obrazowania IVIS spectrum oraz analiza synergii leków z wykorzystaniem wartości indeksu wrażliwości i indeksu kombinacyjnego.
Główne wyniki
- Przesiewowo zbadano dwadzieścia celowanych inhibitorów małocząsteczkowych w połączeniu z temozolomidem.
- Trzynaście związków wykazało dodatnie wartości indeksu wrażliwości, z czego pięć przekroczyło 0,1.
- UMI-77 oraz A 83-01 wykazały najwyższą synergię z temozolomidem (indeks wrażliwości > 0,25).
- Wartości indeksu kombinacji dla temozolomidu i UMI-77 były mniejsze od jedności, co wskazuje na synergistyczne działanie antyproliferacyjne w wielu liniach GSC.
Wnioski
- Opisany protokół umożliwia szybką i efektywną identyfikację synergistycznych kombinacji leków celujących w GSCs.
- UMI-77 oraz A 83-01 są obiecującymi kandydatami do terapii skojarzonej z temozolomidem w GBM.
- Niniejszy schemat postępowania można dostosować do pracy z adherentnymi komórkami nowotworowymi poprzez pominięcie etapu powlekania płytek.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Szybka identyfikacja synergistycznych kombinacji leków celujących w komórki macierzyste glejaków (GSCs) rozwiązuje krytyczny problem w rozwoju terapii glejaków wielopostaciowych (GBM). Niniejszy schemat postępowania umożliwia wysokoprzepustowe, ilościowe przesiewanie w celu zmniejszenia ryzyka strategii łączonych przeciwko wysoce opornym komórkom inicjującym nowotwór. Wczesna integracja takiego przesiewania w procesie badawczym zwiększa pewność predykcyjną i ułatwia selekcję projektów terapeutycznych dla GBM oraz innych nowotworów opornych na leczenie.
Strategiczne zastosowania w badaniach nad biofarmaceutykami&D
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych skoncentrowanych na mechanizmach oporności napędzanych przez GSC.
- Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez bezpośrednie badanie synergii leków w populacjach komórek macierzystych istotnych dla przebiegu choroby.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celu poprzez ilościowe odczyty przeżywalności i proliferacji.
- Zwiększa wiarygodność prognostyczną w zakresie wdrażania schematów terapii skojarzonej w portfelach leków na GBM.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane systemy GSC z tagiem lucyferazy do wydajnych procesów przesiewowych w kolejnych etapach analizy.
- Standaryzuje warunki analizy z wykorzystaniem płytek powlekanych matrigelem oraz powtórzeń technicznych w celu zapewnienia powtarzalności.
- Generuje ilościowe wyniki bioluminescencji w celu niezawodnej oceny i porównania związków.
- Umożliwia skalowalny, wysokoprzepustowy screening wielu kombinacji leków w sposób równoległy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zgodność wyników przesiewowych z biologią GSC istotną dla danej choroby zapewnia ciągłość translacyjną.
- Wspiera dostosowane do ryzyka wdrażanie terapii skojarzonych do przedklinicznych modeli GBM.
- Zapewnia mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez potwierdzenie synergii w wielu liniach GSC pochodzących od pacjentów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy schemat przesiewowy łączy etap wczesnego odkrywania z identyfikacją wiodących związków, umożliwiając szybką, ilościową ocenę synergizmu leków w GSCs pochodzących od pacjentów. Wyniki stanowią podstawę do przedklinicznej priorytetyzacji oraz opracowania strategii biomarkerów translacyjnych dla terapii skojarzonych w GBM.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków w mechanizmach oporności napędzanych przez GSC.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe dane z bioluminescencji do wstępnej selekcji związków.
- Analityka: Zapewnia czułe wartości indeksu oraz indeksu kombinacyjnego w celu porównania synergii w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Zachowuje istotność chorobową dzięki zastosowaniu GSC pochodzących od pacjentów oraz adaptowalnych protokołów dla adherentnych komórek nowotworowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wielorazową, skalowalną platformę do przesiewania kombinacji w ramach portfela onkologicznego.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w opracowywaniu terapii skojarzonych.
- Wartość operacyjna: Usprawnia procesy przesiewowe dzięki standaryzowanym, skalowalnym i powtarzalnym przepływom pracy.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie lepszych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz zwiększa efektywność kapitałową poprzez wczesne skupienie się na kombinacjach synergicznych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój obiecujących terapii GBM.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie hodowli GSC, transdukcji wirusowej oraz cytometrii przepływowej w celu sortowania komórek.
- Wymagany jest dostęp do systemów obrazowania bioluminescencyjnego oraz oprogramowania analitycznego do ilościowych odczytów.
- Konieczna jest standaryzacja konfiguracji testów i protokołów analizy danych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do adaptacji w innych modelach nowotworowych poprzez modyfikację etapów powlekania płytek i przygotowania komórek.
- Wynik zależy od dostępności linii GSC pochodzących od pacjentów oraz zwalidowanych bibliotek związków.
