Wykrywanie przeciwciał neutralizujących SARS-CoV-2 za pomocą wysokoprzepustowego obrazowania fluorescencyjnego infekcji pseudowirusem

Niniejsza metoda umożliwia udzielenie odpowiedzi na jedno z najważniejszych pytań dotyczących opracowywanych szczepionek przeciwko SARS-coronavirus-2. Czy szczepionka jest w stanie wywołać odpowiedź przeciwciał neutralizujących? Główną zaletą tej techniki jest możliwość jej przeprowadzenia w laboratorium o drugim poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL-2). Jest ona również stosunkowo szybka i niedroga, co czyni ją odpowiednią do jednoczesnej analizy wielu próbek.

W celu zademonstrowania procedury neutralizacji kwasu, pomagają nam Ricardo Marius, starszy technik laboratoryjny oraz Taylor Jamieson, student na studiach doktoranckich MD PhD.

Rozpocznij od hodowli komórek Vero E6 w pożywce DMEM uzupełnionej o 10% FBS w temperaturze 37 °C i przy 5% dwutlenku węgla.

Aby przeprowadzić pasażowanie komórek, należy najpierw je wypłukać, dodając 10 milliliters PBS i delikatnie kołysząc naczyniem cztery do pięciu razy. Po odessaniu PBS należy dodać trzy milliliters trypsyny EDTA i zakolysać naczyniem, aby upewnić się, że cała powierzchnia jest pokryta roztworem przed inkubacją w temperaturze 37 °C. Po odklejeniu się komórek należy dezaktywować trypsynę, dodając siedem milliliters DMEM uzupełnionego o 10% FBS, a następnie resuspendować komórki, kilkukrotnie pipetując zawiesinę w górę i w dół.

Usuń trypsynę poprzez wirowanie i odessij nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego, a następnie resuspenduj komórki w 10 ml świeżej pożywki DMEM. Po policzeniu komórek, przenieś około 10⁷ komórek na każdą płytkę 15 cm i inkubuj hodowlę przez jeden do dwóch dni, aż komórki osiągną 100% konfluencji.

Aby przygotować pseudowirus VSV spike EGFP do miareczkowania, zainfekuj komórki z wielokrotnością infekcji 0,01, używając wirusa macierzystego rozcieńczonego w 12 mililitrach DMEM bez surowicy.

Po dodaniu wirusa inkubować komórki przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide, sporadycznie kołysząc naczyniem. Po zakończeniu inkubacji zastąpić inokulum świeżą pożywką DMEM uzupełnioną o 2% FBS i 20 millimolar HEPES, a następnie inkubować komórki w temperaturze 34 °C i 5% carbon dioxide przez 24 godziny. Następnego dnia, przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego, zwizualizować ekspresję EGFP w zainfekowanych komórkach.

Po zaobserwowaniu rozległego efektu cytopatycznego i odrywania się komórek, należy zebrać nadsącz z hodowli i usunąć zanieczyszczenia poprzez wirowanie. Aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania, nadsącz należy rozdzielić na aalikwoty przed przechowywaniem w temperaturze -80 °C.

Aby oznaczyć miano wirusa, wysiej komórki Vero E6 na płytki sześciodołkowe z gęstością siewu 6 × 10⁵ komórek na dołek i inkubuj przez noc. Następnego dnia przygotuj dziesięciokrotny szereg rozcieńczeń zapasu wirusa, dodając 900 µL medium do siedmiu probówek do mikrocentryfugi oraz 100 µL zapasu wirusa do pierwszej probówki. Po krótkim wymieszaniu w wirówce vortex, przenieś 100 µL rozcieńczonego wirusa do każdej kolejnej probówki, mieszając w vortexie po każdym przeniesieniu. Następnie zastąp nadsącz w każdym dołku płytki z kulturą Vero E6 500 µL rozcieńczeń wirusa od 10⁻² do 10⁻⁷.

Po 45-minutowej inkubacji w inkubatorze do hodowli komórkowych z delikatnym kołysaniem co 15 minut, zastąp inokulum roztworem nakładki i inkubuj komórki w temperaturze 34 °C w atmosferze 5% carbon dioxide przez 48 godzin. Po zakończeniu inkubacji, aby zwizualizować plaki za pomocą barwienia fioletem krystalicznym, przemyj komórki raz PBS, a następnie dodaj do każdej studni dwa mililitry 0,1% fioletu krystalicznego. Umieść płytkę na kołysarce na około 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie delikatnie przemyj każdą studnię dwukrotnie PBS.

Po ostatnim płukaniu należy pozostawić płytki do wyschnięcia na powietrzu przez co najmniej jedną godzinę, a następnie zastosować wskazaną formułę w celu obliczenia miana wirusa w każdej studzience w jednostkach tworzących plaki na mililitr. Aby wysiać komórki do testu neutralizacji, należy użyć pipety wielokanałowej, aby dodać 100 µL komórek Vero E6 do każdej studzienki płytki 96-dołkowej z gęstością 2×10⁵ komórek/ml, a następnie inkubować płytkę przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Następnego dnia próbki surowicy pacjentów przeznaczone do badania należy inaktywować termicznie w kąpieli wodnej o temperaturze 56 °C przez 30 minut.

Następnie przygotuj dziesięciokrotny szereg rozcieńczeń próbek surowicy pacjenta w pustej 96-dołkowej płytce do hodowli tkankowej, dodając 8 µL surowicy do 72 µL bezsurowiczego DMEM z antybiotykami w każdym dołku rzędu A. Następnie dodaj 40 µL bezsurowiczego DMEM do każdego dołka w rzędach od B do G oraz 80 µL do każdego dołka rzędu H. Za pomocą 12-kanałowej pipety wielokanałowej wymieszaj próbki w rzędzie A, a następnie przenieś 40 µL próbki z każdego dołka rzędu A do każdego dołka rzędu B. Po wymieszaniu powtórz rozcieńczanie dla każdego kolejnego rzędu dołków aż do rzędu F. Następnie dodaj 40 µL VSV spike EGFP z wielokrotnością infekcji 0,05 do każdego dołka w rzędach od A do G i wymieszaj, pipetując cztery do pięciu razy, przed inkubacją płytki przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Po zakończeniu inkubacji ostrożnie odessań nadsącz z każdego dołka płytki z kulturą Vero E6 i przenieś 60 µL mieszaniny przeciwciał i wirusa z każdego dołka płytki z rozcieńczeniami próbek do odpowiadającego mu dołka płytki z hodowlą komórek. Po przeniesieniu wszystkich próbek umieść płytkę z hodowlą komórek w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na jedną godzinę, kołysząc płytką co 20 minut.

Po zakończeniu inkubacji do każdej studni płytki hodowlanej dodaje się 140 µL roztworu nakładki z karboksymetylocelulozy, a następnie przenosi płytkę do inkubatora ustawionego na 34 °C i 5% CO2. Po 24 godzinach płytki obrazuje się za pomocą automatycznego skanera fluorescencyjnego przy długości fali 488 nm, a do ilościowego oznaczenia poszczególnych ognisk EGFP wykorzystuje się funkcję automatycznego zliczania skanera.

W tym reprezentatywnym przykładzie, w charakterze kontroli pozytywnej zastosowano dostępny komercyjnie przeciwciało neutralizujące przeciwko domenie wiążącej receptor białka spike SARS-coronavirus-2, a w charakterze kontroli negatywnej IgG.

Procent inhibicji obliczono na podstawie liczby ognisk EGFP wykrytych za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Neutralizacja pseudowirusa przez próbki pobrane od pacjentów w okresie rekonwalescencji, około trzech miesięcy po zakażeniu SARS-coronavirus-2, wykazała, że pacjenci hospitalizowani wykazali zwiększoną zdolność neutralizacyjną w porównaniu z osobami, które nie wymagały hospitalizacji. Procedurę tę można również wykorzystać do oceny innych środków zapobiegawczych i terapeutycznych przeciwko COVID-19, których celem jest blokowanie infekcji wirusowej.