Kwantyfikacja gęstości komórkowych i właściwości antygenowych za pomocą lewitacji magnetycznej
17 maja 2021
Ten artykuł opisuje metodę opartą na lewitacji magnetycznej, która może specyficznie wykrywać obecność antygenów, zarówno rozpuszczalnych, jak i związanych z błoną, poprzez ilościowe określanie zmian wysokości lewitacji koralików wychwytujących o stałej gęstości.
Technika ta pozwala na separację różnych typów komórek i komórek poddawanych różnym procesom wyłącznie w oparciu o gęstość, przy niewielkiej lub zerowej manipulacji w krótkim czasie. Głównymi zaletami tej metody jest to, że jest mało inwazyjna, wymaga małych objętości, zapewnia szybkie rezultaty, nie zależy od klasycznych odczytów i nie jest wymagany wyspecjalizowany personel. Technika ta może być stosowana do wykrywania wielu chorób, na przykład niedokrwistości i sepsy.
Aby rozpocząć, użyj nakłuwacza jednym kliknięciem, aby nakłuć palec dawcy krwi z dodatnim czynnikiem Rh i pobrać 10 mikrolitrów krwi w jednym mililitrze DPBS. Dodaj jeden mikrolitr barwnika fluorescencyjnego w jednym mililitrowym zawiesinie komórek dodatnich czynnika Rh do fluorescencyjnie wybarwionej błony plazmatycznej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Osadzaj komórki, wirując z prędkością 5 600 razy G przez 15 sekund i umyj granulkę trzy razy za pomocą jednego mililitra DPBS.
Zawiesić osad w jednym mililitrze HBSS z wapniem i magnezem. Za pomocą nakłuwacza jednym kliknięciem nakłuj palec dawcy krwi z ujemnym czynnikiem Rh i pobierz dwa mikrolitry krwi. Aby przygotować probówkę eksperymentalną zawierającą tylko kulki, dodaj 174 mikrolitry HBSS z wapniem i magnezem, jeden mikrolitr kulek kontrolnych IgG, jeden mikrolitr ciężkich kulek o gęstości 1,2 grama na mililitr i 24 mikrolitry 500 milimolowego gadolinu.
Aby przygotować eksperymentalną probówkę kontrolną zawierającą IgG, dodaj 172 mikrolitry HBSS z wapniem i magnezem, jeden mikrolitr kulek kontrolnych IgG, jeden mikrolitr ciężkich kulek, jeden mikrolitr krwi ujemnej względem czynnika rezus, jeden mikrolitr barwionej zawiesiny krwi dodatniej pod względem czynnika Rh i 24 mikrolitry 500 milimolowego gadolinu. Aby przygotować probówkę eksperymentalną próbki, dodaj 172 mikrolitry HBSS z wapniem i magnezem, jeden mikrolitr kulek powlekanych anty-RhD, jeden mikrolitr ciężkich kulek, jeden mikrolitr krwi ujemnej względem czynnika Rh, jeden mikrolitr barwionej zawiesiny krwi dodatniej pod względem czynnika Rh i 24 mikrolitry 500 milimolowego gadolinu. Skonfiguruj urządzenie lewitacji magnetycznej.
I załaduj 50 mikrolitrów próbki do rurki kapilarnej, aż probówka zostanie napełniona. Uszczelnij końce rurki kapilarnej szczeliwem kapilarnym, upewniając się, że nie ma pęcherzyków. Umieść rurkę kapilarną w uchwycie kapilary między górnym i dolnym magnesem, wyreguluj stage i skup się, aby uzyskać optymalne viewing.
Odczekaj około pięciu do 20 minut, aż komórki i kulki osiądą w pozycji równowagi magnetycznej. Korzystając z tego protokołu, komórki krwi zostały oddzielone w zależności od wysokości lewitacji za pomocą urządzenia do lewitacji magnetycznej. Koraliki o niskiej i wysokiej gęstości zostały użyte do zapewnienia wysokości lewitacji gęstości i odniesienia rozmiaru.
Komórki wielojądrzaste lewitowały nad czerwonymi krwinkami przy stężeniu 21 milimolowych jonów gadolinu. Stare krwinki lewitowały przy stężeniu jonów gadolinu 60 milimolowym. Czerwone krwinki, komórki wielojądrzaste i limfocyty oddzielono przy 40-milimolowym stężeniu jonów gadolinu w oparciu o ich wewnętrzną gęstość.
Antygen czynnika Rh wykryto na krwinkach czerwonych za pomocą kulek pokrytych przeciwciałami IgG i anty-RhD. Kompleksy krwinek czerwonych nie zostały wygenerowane w próbce kontrolnej IgG, ale wykryto fluorescencyjnie zabarwione krwinki czerwone wychwycone przez kulki dodatnie czynnika Rh. Wiązanie anty-RhB z komórkami dodatnimi czynnika Rh utworzyło kompleks komórek koralików w środku przy przerywanej gęstości niezwiązanych kulek i ujemnych czerwonych krwinek.
Co więcej, tworzenie się kompleksu zostało potwierdzone obserwacją emitowanej fluorescencji. Kompleksy kulek B utworzone między kulkami o wysokiej i niskiej gęstości pokrytymi przeciwciałami dla CR1 i CD47 wskazują na obecność pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z czerwonych krwinek. Zamknięcie kapilary bez wprowadzania pęcherzyków jest najtrudniejszym krokiem i wymaga praktyki.
Metoda ta może dostarczyć informacji dla hematologii, szczególnie skoncentrowanej na chorobach czerwonych krwinek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia technikę opartą na lewitacji magnetycznej do specyficznego wykrywania antygenów w próbkach krwi, skupiając się na ich właściwościach gęstościowych. Metoda ta wykazuje skuteczność w rozdzielaniu różnych typów komórek oraz identyfikacji czynnika Rh w erytrocytach przy minimalnej inwazyjności i krótkim czasie analizy.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Techniki diagnostyczne w hematologii
- Rozdział typów komórek w oparciu o właściwości fizyczne
- Wykrywanie antygenów krwi w celu identyfikacji chorób
Wstęp
- Znaczenie gęstości komórkowej w analizie krwi
- Wyzwania w tradycyjnym przetwarzaniu próbek krwi
- Zastosowania w wykrywaniu stanów takich jak anemia i sepsa
Zastosowane metody
- Lewitacja magnetyczna w detekcji antygenów
- Próbki krwi od dawców z dodatnim i ujemnym czynnikiem Rh
- Barwienie barwnikami fluorescencyjnymi i testy oparte na koralikach
Główne wyniki
- Skuteczna separacja komórek krwi na podstawie ich gęstości z wykorzystaniem lewitacji magnetycznej
- Wykrywanie antygenów czynnika Rh za pomocą kompleksów koralików
- Wyraźne rozróżnienie między komórkami wielojądrowymi, limfocytami i erytrocytami
Wnioski
- Metoda ta zwiększa możliwości analizy próbek krwi przy ograniczeniu liczby manipulacji
- Otwiera nową drogę badań nad schorzeniami hematologicznymi
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Lewitacja magnetyczna umożliwia szybką, bezznakową separację komórek na podstawie ich gęstości właściwej, co wspiera wczesne etapy procesów badawczych, w których walidacja celu i screening fenotypowy wymagają minimalnej manipulacji. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie obecności antygenu poprzez tworzenie kompleksów koralik-koralik, oferując skalowalne podejście do opracowywania testów w programach badawczych skoncentrowanych na hematologii. Kompatybilność tej metody ze standardowymi technikami obrazowania zmniejsza zależność od specjalistycznej aparatury, zwiększając dostępność dla interdyscyplinarnych zespołów badawczo-rozwojowych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez rozdzielanie podtypów komórek w oparciu o powiązane z gęstością stany metaboliczne i aktywacyjne.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu przy minimalnym przetwarzaniu próbek, co redukuje zmienność wynikającą z etapów manipulacji.
- Wartość predykcyjna: Ułatwia stratyfikację populacji komórek zgodną z biomarkerami w celu ograniczenia ryzyka związanego z hipotezami dotyczącymi oddziaływania na cel.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Generuje ilościowe pomiary antygenów poprzez wysokość lewitacji kompleksu koralik-koralik, co umożliwia analizę zależności dawka-odpowiedź.
- Powtarzalność: Zapewnia standaryzowaną separację opartą na właściwościach fizycznych, minimalizując zmienność między seriami w testach opartych na komórkach.
- Skalowalność platformy: Kompatybilna z obrazowaniem za pomocą smartfona lub tabletu, co wspiera zdecentralizowany screening oraz zastosowania w miejscu opieki nad pacjentem (point-of-need).
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie w badaniach nad chorobami: Bezpośrednie zastosowanie w modelach chorób hematologicznych, w tym w anemii i anemii sierpowatej, poprzez separację komórek opartą na gęstości.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etapy odkrywcze z procesami przedklinicznymi poprzez zachowanie natywnych stanów komórek podczas separacji.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Umożliwia wczesne wykrywanie krążących komórek nowotworowych i pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, wspierając decyzje typu go/no-go w projektach onkologicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesny etap procesu odkrywania, wspierając testowanie hipotez w walidacji celu oraz umożliwiając tworzenie systemów gotowych do analizy w późniejszych kampaniach przesiewowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez izolację subpopulacji komórek o odmiennych profilach gęstości powiązanych ze stanem różnicowania.
- Screening: Dostarcza ilościowych odczytów opartych na obrazowaniu do oceny efektu związków bez polegania na reporterach fluorescencyjnych lub enzymatycznych.
- Analityka: Wykorzystuje wysokość lewitacji jako mierzalny wynik do porównywania warunków i oceny modulacji celu.
- Badania translacyjne: Zachowuje integralność fenotypową rozdzielonych komórek, co zapewnia ciągłość w testach walidacji funkcjonalnej.
- Zastosowania przedsiębiorstwa: Stanowi wielokrotnego użytku platformę separacji, którą można zastosować w wielu klasach celów i obszarach chorobowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w testach komórkowych dzięki separacji bez użycia znaczników.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i przepustowość dzięki standaryzowanemu pozycjonowaniu w równowadze magnetycznej.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez minimalizację zależności od odczynników i ograniczenie zapotrzebowania na specjalistyczne szkolenia.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko dzięki wczesnemu wykrywaniu rzadkich populacji komórek i poziomów antygenów.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymaga doświadczenia w konfiguracji lewitacji magnetycznej oraz obchodzeniu się z kapilarami w celu uniknięcia powstawania pęcherzyków powietrza.
- Zależy od dostępu do regulowanych pól magnetycznych i systemów kulek o skalibrowanej gęstości.
- Wymaga standaryzacji protokołów sprzęgania antygenów z kulkami w celu uzyskania powtarzalnych wyników ilościowych.
- Adaptacja do układów niehematologicznych może wymagać optymalizacji gęstości kulek oraz parametrów magnetycznych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują wrażliwość na jakość uszczelnienia kapilar oraz zmienność czasu równoważenia.
