Mikroskopia fluorescencyjna w celu internalizacji ATP za pośrednictwem makropinocytozy w ludzkich komórkach nowotworowych i myszach z ksenoprzeszczepem guza

Komórki rakowe mają niezwykłą zdolność do internalizacji składników odżywczych, takich jak ATP, ze środowiska zewnątrzkomórkowego. Nasz protokół pozwala nam zademonstrować internalizację ATP i wizualizować lokalizację ATP w komórkach. To obrazowanie w wysokiej rozdzielczości zinternalizowanego ATP w makropinozomach jest idealne do zrozumienia szczególnej lokalizacji i zakończenia analizy internalizacji.

Protokół opisuje różne eksperymentalne zastosowania do badania internalizacji ATP. Metoda ta może być stosowana do badania różnych mechanizmów internalizacji komórkowej, w tym makropinocytozy i endocytozy za pośrednictwem egzosomów. W przypadku chorób metabolicznych za pomocą tego protokołu można badać internalizację ATP w komórkach nienowotworowych.

Na początek zasiej komórki rakowe w kolbie o powierzchni 225 centymetrów kwadratowych, zawierającej DMEM uzupełniony FBS i antybiotykami. Pozwól komórkom rosnąć w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po osiągnięciu 80% konfluencji odłącz komórki i osadź odłączone komórki przez odwirowanie, a następnie ponownie zawieś komórki w lodowatym PBS, aby osiągnąć gęstość komórek od 5 razy 10 do 6 komórek na 100 mikrolitrów PBS.

Przenieś zawiesinę komórek do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Oczyść miejsce wstrzyknięcia na boku myszy z niedoborem odporności 75% etanolem i wytrzyj nadmiar etanolu delikatną chusteczką do ćwiczeń. Narysuj komórki do jednomililitrowej strzykawki bez lateksu, wyposażonej w precyzyjną igłę ślizgową o rozmiarze 27.

W przypadku wstrzyknięcia podskórnego należy trzymać igłę pod kątem około 10 stopni do skóry i wprowadzić końcówkę igły skosem skierowanym do góry pod skórą, pozostawiając tylko jeden do dwóch milimetrów igły poza skórą. Dozować komórki ze strzykawki powoli przez około 10 sekund. Po wstrzyknięciu całej objętości należy przytrzymać igłę na miejscu przez trzy do pięciu sekund, a następnie wyjąć igłę.

Delikatnie ale mocno uciskać palcami miejsce wstrzyknięcia przez trzy do pięciu sekund, aby zapobiec wyciekaniu wstrzykniętej zawartości. Monitoruj i mierz wzrost guza za pomocą suwmiarki, aż guzy osiągną objętość od 200 do 500 milimetrów sześciennych. Rozpuścić 300 mikrolitrów po 16 miligramów na mililitr fluorescencyjnego dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej i DMEM bez surowicy i inkubować w łaźni wodnej, hartować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, następnie odwirować roztwór dekstranu i przenieść supernatant do nowej 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki.

Przy 40 mikrolitrach jednomilimolowy, niehydrolizowalny fluorescencyjny analog ATP łączy się ze 160 mikrolitrami DMEM bez surowicy, aby uzyskać 0,2 milimolowego niehydrolizowanego fluorescencyjnego roztworu ATP. Przygotować roztwory do traktowania DMEM lub osiem miligramów na mililitr dekstranu fluorescencyjnego o wysokiej lub niskiej masie cząsteczkowej, z lub bez 100 mikromolowych niehydrolizowalnych fluorescencyjnych ATP w DMEM, mieszając przygotowane wcześniej roztwory podstawowe. Użyj strzykawki o pojemności jednego mililitra, aby zebrać 50 mikrolitrów jednego roztworu leczniczego.

Wstrzyknąć roztwór bezpośrednio do guza ksenoprzeszczepu i powtórzyć dla czterech powtórzeń biologicznych każdego zabiegu. Po eutanazji myszy i wyizolowaniu tkanki nowotworowej, użyj perforowanej łyżki, aby zebrać wyciętą tkankę nowotworową i natychmiast umieść tkankę w pożywce zamrażającej i zwiń tkankę, upewniając się, że tkanka pozostaje zanurzona w pożywce, kąpie wszystkie powierzchnie tkanki. Ostrożnie umieść chusteczkę w formie do zatapiania zawierającej pożywkę do zamrażania.

Umieść odpowiednią etykietę pionowo w podłożu do zamrażania lub formie, upewniając się, że napisana etykieta jest widoczna na zewnątrz podłoża. Gdy pożywka zamrażająca zmieni kolor na nieprzezroczysty biały, wyjmij blok tkanki z formy, umieść blok tkanki na suchym lodzie i powtórz zamrażanie dla każdej sekcji guza. Przechowuj bloki tkanek w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez kilka miesięcy przed zabiegiem kriosekcji.

Po wykonaniu szkiełek bloków tkankowych, zamocuj szkiełka sekcji tkanki w 95% etanolu w temperaturze minus 18 stopni Celsjusza przez pięć minut. Myj stałą sekcję PBS przez pięć minut. Dodać od 10 do 50 mikrolitrów wodnego podłoża montażowego z DAPI do skrawków tkanki, zgodnie z rozmiarem skrawków, i umieścić szkiełko nakrywkowe na skrawku tkanki.

Po 12 do 24 godzinach od montażu zidentyfikuj obszary zainteresowania stałych odcinków guza i uzyskaj obrazy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, jak pokazano wcześniej. Po dwóch do 24 godzinach od utrwalenia ludzkich komórek nowotworowych i staniu z DAPI, uchwyć obrazy za pomocą systemu obrazowania epifluorescencyjnego i oprogramowania do akwizycji danych. Umieść szkiełko na stoliku pionowego mikroskopu epiflorescencyjnego w trybie lornetkowym.

Otwórz program do obrazowania, wybierz obiektyw 10 razy i dostosuj stolik, aby określić ostrość. Zeskanuj slajd od lewej do prawej w serpentynowy, aby zidentyfikować interesujące Cię obszary. Wybierz obiektyw 40-krotny i użyj przełącznika na mikroskopie, aby przełączyć się z trybu lornetki na tryb przechwytywania obrazu.

Kliknij ikonę jakości na żywo, aby wyświetlić, a następnie pobrać obrazy. Użyj panelu OC na pasku narzędzi akwizycji, aby zdefiniować parametry ekspozycji dla każdej kostki filtra lub kanału fluorescencyjnego, a następnie użyj paska narzędzi akwizycji wielokanałowej, aby uzyskać obraz z trzema kanałami ze zdefiniowanymi ustawieniami ekspozycji. Alternatywnie, obrazy wielokanałowe można rejestrować ręcznie, przełączając się między kostkami filtrów, ustawiając czas ekspozycji, zamykając lub otwierając migawkę między akwizycją obrazu dla każdego kanału i nakładając każde zdjęcie zrobione dla poszczególnych kanałów.

Zapisz obraz jako plik nd2. Zapisz pliki TIF, w tym scalony obraz kanału i obrazy poszczególnych kanałów. Użyj funkcji zliczania obiektów na pasku narzędzi adnotacji i pomiarów, aby policzyć liczbę komórek fluorescencyjnych NHF-ATP, TMR fluorescencyjnych dekstranów o wysokiej masie cząsteczkowej i TMR o niskiej masie cząsteczkowej fluorescencyjnych dodatnich dekstranów w zapisanym pliku obrazu nd2 i wyeksportować dane do arkusza kalkulacyjnego za pomocą programu do analizy.

Protokół ten został opracowany do przestrzennej, czasowej i ilościowej analizy internalizacji komórkowej niehydrolizowanego ATP. Wewnątrzkomórkową internalizację niehydrolizowanego fluorescencyjnego ATP wykazano poprzez kolokalizację niehydrolizowanego fluorescencyjnego ATP z fluorescencyjnym dekstranem o wysokiej lub niskiej masie cząsteczkowej in vitro, ex vivo i in vivo. Aby zapewnić, że komórki nowotworowe zachowają zinternalizowane ATP, ograniczono czas eksperymentu dla wszystkich wstrzyknięć doguzowych do krioosadzania.

Uwzględnij również zmienność wewnątrznowotworową, obrazując tkankę w całym guzie. Przyszłe iteracje naszej metody mogą obejmować wizualizację procesu internalizacji E-ATP w czasie rzeczywistym, ujawniając informacje o kinetyce makropynocytotycznej i transporcie w określonych tkankach.