Pirosekwencjonowanie: prosta metoda dokładnego genotypowania

Badania genetyczne znacznie skorzystały z udostępnienia sekwencji ludzkiego genomu. Sekwencjonowanie pirochemiczne to unikalny system, który umożliwia analizę zmienności genetycznej, a także niezrównoważenia allelicznego RNA, stanu metylacji DNA oraz liczby kopii genów. W tym filmie prezentujemy podstawową reakcję sekwencjonowania pirochemicznego do analizy genetycznej.

Witam, nazywam się Kristy King i reprezentuję laboratorium dr. Charlesa Eby’ego oraz dr. Briana Gage'a z Katedry Chorób Wewnętrznych w Washington University School of Medicine. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę sekwencjonowania pirosequencing. Procedura ta jest użyteczna, ponieważ stanowi jedną z najdokładniejszych, a zarazem najprostszych metod stosowanych do analizy SNP.

Sekwencjonowanie pirochemiczne opiera się na sekwencjonowaniu poprzez syntezę, wykorzystując uwalnianie pirofosforanu podczas każdego wbudowania nukleotydu w otwartą nić DNA z końcem 3'. Po załadowaniu płytki nukleotydy są wbudowywane zgodnie z sekwencją dostarczoną przez oprogramowanie. Uwolniony pirofosforan bierze udział w reakcji skutkującej uwolnieniem ATP, który jest wykorzystywany przez lucyferazę do przekształcenia lucyferyny w oksylucyferynę, co prowadzi do emisji światła. Emitowane światło jest zbierane przez kamerę CCD i rejestrowane jako piki, znane również jako pirosekwencje.

Wszystkie nukleotydy niewłączone do nici DNA są degradowane przez AP pyra w celu wyeliminowania szumu tła. Procedura ta obejmuje następujące etapy: projektowanie analizy, elektroforezę żelową PCR w celu kontroli jakości oraz sekwencjonowanie pirosequencing.

Zacznijmy od sekwencjonowania pirosekwencyjnego. Aby przeprowadzić sekwencjonowanie pirosekwencyjne, w pierwszej kolejności należy przygotować produkt PCR. PCR do sekwencjonowania pirosekwencyjnego wymaga więcej cykli niż większość reakcji PCR, aby zapewnić całkowite zużycie wszystkich starterów – zazwyczaj około 50 cykli.

Sekwencjonowanie pirosekwencyjne wymaga również, aby jeden z primerów PCR był biotynilowany. Na koniec należy zauważyć, że wymagany jest również primer wewnętrzny. W celu zapewnienia braku kontaminacji, projektowanie wydajnego testu można przeprowadzić za pomocą oprogramowania dostarczanego wraz z systemem do pirosekwencjonowania.

Aby potwierdzić obecność produktu PCR, należy przeprowadzić elektroforezę żelową dla kilku próbek oraz kontroli negatywnej. W celu przygotowania płytki do sekwencjonowania pirosequencyjnego, do płytki 96-dołkowej należy dodać 12 µL mieszaniny starterów do pirosekwencjonowania. Wymaga to przygotowania mieszaniny składającej się z 43,2 µL startera wewnętrznego oraz 1396,8 µL buforu wyżarzającego; następnie płytkę do pirosekwencjonowania należy przykryć folią przylepną.

Jeśli przygotowanie zajmie więcej niż 50 minut, do każdej studni płytki PCR 96-dołkowej należy dodać 70 µL mieszaniny SRO speed mix, która zawiera 240 µL kulek sero speeds 4 powlekanych streptawidyną, 560 µL buforu wiążącego, składającego się z TRIS, chlorku sodu, EDTA i tween 20 oraz 3 600 µL wody, a następnie szczelnie zamknąć pokrywkę. Płytkę PCR 96-dołkową z mieszaniną kulek należy umieścić w wytrząsarku do płytek na pięć minut w temperaturze pokojowej.

Upewnij się, że pokrywka jest szczelnie zamknięta, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej między dołkami. Ten etap umożliwi dokładne przyłączenie kulek spheros powlekanych strep ENC do znacznika biotynowego znajdującego się na starterze PCR. Przygotuj stanowisko do przygotowania płytek.

Obejmuje to korytka na odczynniki, tackę na mieszaninę produktów PCR i kulek oraz tackę na primery do sekwencjonowania pirosequencing. Należy upewnić się, że płytka z mieszaniną produktów PCR i kulek, a także tacka na primery do sekwencjonowania pirosequencing są odpowiednio wyrównane, tak aby próbki ujemne znajdowały się w tej samej orientacji. Przed przenoszeniem próbek należy wstrząsnąć wyłączonym narzędziem próżniowym w czystej wodzie, aby usunąć wszelkie kulki lub zanieczyszczenia, które mogą się na nim znajdować.

Wylać pozostałą wodę, ponownie napełnić korytko i włączyć próżnię. Pozostawić końcówkę odsysającą w korytku aż do usunięcia całej wody, co zajmuje około 30 sekund. Umieścić końcówki filtrujące narzędzia próżniowego w studzienkach płytki z mieszaniną kulek PCR i pozostawić je tam, dopóki cała ciecz nie zostanie usunięta z płytki.

W celu zapobiegania powstawaniu napięcia powierzchniowego można zastosować delikatne kołysanie. Umieść końcówkę próżniową w korytku z 70% etanolem w momencie, gdy ciecz zacznie przepływać przez rurkę. Pozwól, aby końcówki filtracyjne wessały etanol przez pięć sekund.

Powtórz czynność dla 0,2 molarnego wodorotlenku sodu, który denaturuje DNA do jednoniciowej formy PCR, oraz dla buforu płuczącego. Służy on do oczyszczenia i neutralizacji produktu PCR. Odłącz wąż ssawny od narzędzia próżniowego i umieść narzędzie próżniowe w płytce do sekwencjonowania pirosequencingowego zawierającej starter do sekwencjonowania pirosequencingowego w mieszaninie buforu wyżarzającego.

Jeśli wąż próżniowy jest nadal podłączony, po umieszczeniu go w płytce do sekwencjonowania piro, mieszanina starterów zostanie zassana. Końcówki spowodują utratę produktu PCR. Delikatnie potrząśnij lub zakoleb końcówkami próżni w dołkach płytki do sekwencjonowania piro, aby rozprowadzić produkt PCR.

Po zakończeniu wstrząsania lub kołysania usuń narzędzie próżniowe z płytki do pirosekwencjonowania, ponownie podłącz narzędzie do węża i zanurz je w czystej wodzie w celu oczyszczenia przed użyciem kolejnej płytki. Umieść płytkę do pirosekwencjonowania na bloku grzewczym na dwie minuty w temperaturze 80 °C. Po dwóch minutach zdejmij płytkę z bloku grzewczego i połóż ją na chłodnej powierzchni.

Po ostygnięciu można użyć folii przylepnej do przykrycia płytki, chyba że płytka zostanie poddana analizie w ciągu 15 minut, aby zapobiec parowaniu. Teraz nadszedł czas, aby rozpocząć sekwencjonowanie pirochemiczne. Pierwszym krokiem sekwencjonowania pirochemicznego jest wprowadzenie szczegółów analizy do komputera.

W sekcji wpisu simplex wybierz nowy wpis i wprowadź informacje o analizie, w tym nazwę identyfikatora oraz sekwencję do analizy, która jest dostarczana przez oprogramowanie do projektowania analiz i umożliwia kontrolę jakości; wybierz kolejność dozowania, która określa sekwencję wokół SNP wraz z bazami kontrolnymi. Na koniec wybierz histogramy, aby uzyskać wizualizację tego, jak powinien wyglądać Twój pyrogram. Teraz należy wprowadzić uruchomienie snip.

W zakładce „Snip runs” oraz zakładce ogólnej wprowadź nazwę serii pomiarowej i wybierz parametry instrumentu dla danego uruchomienia. W zakładce „Setup” wybierz wpis testu, a następnie kliknij i przeciągnij go nad płytką. Przy wprowadzaniu wybranego testu do płytki należy pamiętać, że nie trzeba wykorzystywać całej płytki – można dezaktywować poszczególne studzienki w celu wyłączenia ich z analizy, a na jednej płytce można przeprowadzić wiele różnych testów.

Kliknij kartę widoku, a następnie wybierz Run. Na tej stronie wymienione są odpowiednie objętości nukleotydów, enzymu i substratu potrzebne do przeprowadzenia analizy. Przed użyciem należy oczyścić końcówki do nukleotydów lub kapilar oraz końcówki do odczynników.

Napełnij końcówki wodą i wywrzyj nacisk na górną część końcówki, aby sprawdzić, czy nie występują żadne zatory. Jeśli woda nie wypływa z dołu końcówki, opróżnij ją i napełnij ponownie kilka razy, aby spróbować przepchnąć wodę. Jeśli końcówka nadal pozostaje zablokowana, można ją poddać sonikacji.

Wyrzuć i pobierz nowe końcówki. Enzym oraz substrat należy resuspender w wodzie przed użyciem. Jeśli zostaną wstrząśnięte, mogą powstać pęcherzyki powietrza powodujące zatory w końcówkach lub nierównomierne dozowanie; niewykorzystany resuspenderowany enzym i substrat można przechowywać w temperaturze -20°C.

W celu przyszłego wykorzystania końcówek kapilarnych do dozowania w probówce do mikrowirówki, należy przygotować rozcieńczenie jeden do jednego z nukleotydami oraz buforem TE P8. Przed użyciem dokładnie wymieszać. Napełnić końcówki z nukleotydami i odczynnikami odpowiednimi objętościami zgodnie z ilościami sugerowanymi przez oprogramowanie.

Powoli dozuj ciecz po ściankach końcówek, aby zapobiec zasysaniu pęcherzyków powietrza, które mogłyby spowodować zatory. Należy upewnić się, czy w końcówkach do dozowania nukleotydów nie znajdują się pęcherzyki powietrza. W przypadku ich wystąpienia należy delikatnie opukać ścianki końcówek, aż pęcherzyki wypłyną na powierzchnię, lub usunąć je za pomocą czystej końcówki do pipety.

Po napełnieniu kartridża przeprowadź test na płytce próbnej. Umieść kartridż w sekwenatorze pirosequencingowym, a płytkę próbną na platformie dla płytek 96-dołkowych. Nałożenie folii przylepnej na płytkę umożliwia łatwą obserwację dozowania odczynników i nukleotydów.

Wybierz zakładkę instrumentu po lewej stronie ekranu, a następnie kliknij zarządzaj. Wybierz instrument z menu rozwijanego. Kliknij testuj, po czym pojawi się ostrzeżenie.

Zatwierdź informację o sprawdzeniu, czy płytka testowa została umieszczona w urządzeniu, klikając OK. Po zakończeniu procesu wyjmij płytkę testową; na środku płytki powinny znajdować się kropelki cieczy w sześciu studzienkach, reprezentujące cztery nukleotydy, enzym oraz substrat.

Jeśli pojawi się mniej niż sześć małych kropek, oznacza to wystąpienie zatoru; należy wtedy sprawdzić końcówki i usunąć wszelkie zatory. Umieść płytkę na platformie do płytek 96-dołkowych do sekwencjonowania pirochemicznego. Zamknij wszystkie dźwignie i kliknij „run” (uruchom) dla poszczególnej płytki.

Po skonfigurowaniu serii, enzym, substrat i nukleotydy zostaną dozowane w predetermined kolejności. Gdy sekwenator pirosekwencyjny przeanalizuje przebieg procesu, należy przejść do badania wyników. Niebieskie studzienki oznaczają poprawny genotyp i pirosekwencję.

Pomarańczowe studzienki wymagają interwencji użytkownika i mogą zostać zredagowane poprzez kliknięcie wybranej studzienki i otwarcie przewidywanego histogramu. Genotyp może zostać zatwierdzony, odrzucony lub zweryfikowany, a sam genotyp może zostać odpowiednio zmieniony. Po zredagowaniu studzienki na mapie płytki pojawi się ciemne koło.

Kontrole negatywne powinny zostać ocenione jako negatywne. W studzienkach negatywnych mogą pojawić się niespecyficzne piki, jednak zazwyczaj są one spowodowane tworzeniem pętli przez wewnętrzny primer. W ten sposób pokazaliśmy, jak sekwencjonować polimorfizm w ludzkim genomie.

Sekwencjonowanie DNA metodą pirosekwencjonowania jest bardziej użyteczne niż inne procedury sekwencjonowania, ponieważ można je dostosować do szerokiego zakresu zastosowań. Jest ono również na tyle odporne, aby umożliwić analizę DNA z dowolnego źródła, w tym DNA o niskim stężeniu i zdegradowanego. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby rozpocząć od czystego produktu PCR.

Uwzględnij kontrolę negatywną dla każdego testu i upewnij się, że wszystkie odczynniki są odpowiedniej jakości. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w przeprowadzaniu doświadczeń.