Przygotowanie próbki do trójwymiarowej wizualizacji naczyń kończyn tylnych myszy w oparciu o tomografię komputerową
7 października 2021
Tutaj opisujemy metodę wizualizacji i kwantyfikacji naczyń mysich kończyn tylnych za pomocą mikrorentgenowskiej tomografii komputerowej.
Możliwe jest wykonanie zdjęć CT naczyń krwionośnych kończyn dolnych i narządów jamy brzusznej przy użyciu protokołu krokowego. Metoda umożliwia kompleksową ocenę całych naczyń krwionośnych. Ponadto możliwa jest ocena samych tętnic lub jednocześnie tętnic i żył.
Bardzo ważne jest, aby zapobiegać powstawaniu zakrzepów krwi, wyciekom lub studni krwi oraz unikać pęcherzyków powietrza. Przed operacją należy wstrzyknąć 1 jednostkę/gram heparyny w PBS do jamy dootrzewnowej myszy. Po 30 minutach wykonaj nacięcie w linii środkowej mostka myszy poddanej eutanazji i przymocuj otwartą klatkę piersiową za pomocą szpilek.
Przetnij aortę wstępującą przed usunięciem serca, a następnie usuń płuco, aby odsłonić aortę zstępującą. Przetnij aortę zstępującą po przekątnej, aby odsłonić przekrój naczynia. Następnie wprowadź cewnik o rozmiarze 22 do aorty zstępującej, jednocześnie uruchamiając bufor rozszerzający naczynia krwionośne.
Przypnij korzeń cewnika i zawiąż węzeł, aby zapobiec wyciekowi z powodu przepływu wstecznego. Po zakończeniu rozpocznij perfuzję podgrzanym roztworem rozszerzającym naczynia krwionośne pod stałym ciśnieniem od 13 do 15 kilopaskalów. Po trzech minutach perfuzjuj roztwór 4% paraformaldehydu w PBS przez 3 minuty.
Zatrzymać perfuzję i napełnić rurkę przedłużającą podłączoną do cewnika 2 ml świeżo przygotowanego środka kontrastowego rozcieńczonego w stosunku 1:1 do perfuzji w ustalonym ciśnieniu od 13 do 15 kilopaskalów. Aby uwidocznić tętnice, sprawdź paznokieć u nogi jamy ustnej, aby upewnić się, że środek kontrastowy dotarł do tętnicy. W ten sam sposób sprawdź żyłę główną dolną przepony, aby potwierdzić pełne krążenie środka kontrastowego i uwidocznić wszystkie naczynia.
Jeśli krążenie środka kontrastowego jest zakończone, zamknij zawór trójdrogowy i wyjmij rurkę. Próbkę inkubować przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza. W tym protokole uwidoczniono wszystkie naczynia w kończynach dolnych myszy.
Wyniki badania modelu niedokrwienia kończyn tylnych potwierdziły, że niepodwiązana tętnica udowa biegła równolegle do żyły udowej. Przerwa w podawaniu środków kontrastowych ułatwiła również obserwację podwiązanej tętnicy udowej i rozwój naczyń pobocznych. Można było zobaczyć kilka naczyń wypełnionych środkiem kontrastowym.
Z drugiej strony zauważono również zakłócenia w działaniu środków kontrastowych spowodowane mieszaniem się środków niekontrastowych lub niedostateczną perfuzją. Niemożliwe było oglądnięcie tętnic na powierzchni ciała za pomocą obserwacji mikroskopowej lub stereomikroskopowej środka kontrastowego, co ułatwiało ocenę ubytków w układzie naczyniowym. Bardzo ważne jest, aby podczas wprowadzania cewnika unikać pęcherzyków powietrza.
Ponieważ ich narządy jamy brzusznej są również rozluźnione, możliwe jest wyjęcie z narządów i wykonanie tomografii komputerowej. Dzięki zastosowaniu tej metody udało nam się zidentyfikować nową ćwiartkę nasycenia.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodę wizualizacji i kwantyfikacji naczyń kończyn dolnych myszy z wykorzystaniem mikrotomografii komputerowej promieni rentgenowskich. Technika ta umożliwia kompleksową ocenę naczyń krwionośnych w kończynach dolnych oraz narządach jamy brzusznej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia naczyniowa
- Techniki obrazowania
Wstęp
- Mikrotomografia komputerowa rentgenowska jest potężnym narzędziem obrazowania.
- Zrozumienie struktury naczyń krwionośnych jest kluczowe dla wielu badań biologicznych.
- Poprzednie metody mogły nie zapewniać kompleksowej wizualizacji.
- Celem niniejszego badania jest udoskonalenie technik wizualizacji dla modeli mysich.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody wizualizacji naczyń kończyn tylnych.
- Umożliwienie kwantyfikacji struktur naczyniowych w modelach mysich.
- Ocena wpływu interwencji na stan naczyń krwionośnych.
Zastosowane metody
- Wtryskiwanie heparyny w celu zapobiegania zakrzepom krwi.
- Perfuzja środka kontrastowego w celu wizualizacji naczyń krwionośnych.
- Obrazowanie tomograficzne (CT) w celu uchwycenia szczegółowych struktur naczyniowych.
- Ocena zarówno tętnic, jak i żył w kończynach tylnych.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja wszystkich naczyń w kończynach dolnych.
- Identyfikacja naczyń pobocznych w modelu niedokrwienia kończyny tylnej.
- Odnotowano problemy związane z pęcherzykami powietrza i niepełną perfuzją.
- Metoda pozwoliła na ocenę wad naczyniowych.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia kompleksowe podejście do obrazowania naczyń krwionośnych.
- Może ona zwiększyć zrozumienie schorzeń naczyniowych w modelach mysich.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować badania nad zdrowiem i chorobami naczyń krwionośnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia kompleksową wizualizację 3D sieci naczyniowych myszy, wspierając przedkliniczną ocenę odpowiedzi angiogennych oraz patologii naczyniowych. Poprzez dostarczenie ilościowych danych strukturalnych z naczyń kończyn dolnych i organów jamy brzusznej, usprawnia ona walidację celów w biologii naczyniowej i modelach chorób niedokrwiennych. Technika ta zwiększa wiarygodność prognostyczną w identyfikacji wiodących cząsteczek (lead identification) poprzez ograniczenie zależności od sekcjonowania 2D i umożliwienie bezpośredniej obserwacji architektury naczyniowej oraz tworzenia naczyń pobocznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych związanych z angiogenezą i przebudową naczyniową w modelach niedokrwiennych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia funkcjonalną walidację celów naczyniowych poprzez bezpośrednie obrazowanie 3D defektów perfuzji i rozwoju krążenia obocznego.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów badawczych poprzez ilościowe określanie odpowiedzi naczyniowej na interwencje farmakologiczne lub genetyczne.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zestandaryzowane systemy biologiczne do dalszego przesiewu związków poprzez ustalenie podstawowej morfologii naczyniowej.
- Wyniki ilościowe: Dostarcza mierzalne parametry naczyniowe, takie jak gęstość naczyń, wzorce rozgałęzień i stopień ukrwienia, w celu standaryzacji analizy.
- Skalowalność: Kompatybilność z platformami mikro-CT umożliwia powtarzalne obrazowanie w różnych laboratoriach i ośrodkach badawczych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Modeluje fizjologiczną i patologiczną angiogenezę w niedokrwieniu kończyny dolnej, wspierając dopasowanie translacyjnych biomarkerów.
- Ciągłość przedkliniczna: Łączy wyniki badań przesiewowych z walidacją przedkliniczną, umożliwiając podłużną ocenę naczyniową.
- Decyzje dostosowane do ryzyka: Dostarcza informacji do kryteriów go/no-go poprzez wizualizację defektów naczyniowych i mechanizmów kompensacyjnych wpływających na skuteczność leku.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, w szczególności w fazach walidacji celu oraz optymalizacji związku wiodącego, gdzie fenotypy naczyniowe stanowią kluczowe parametry odczytu.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących szlaków angiogennych i integralności naczyniowej w modelach chorób.
- Przesiewy: Umożliwia tworzenie gotowych do analizy modeli naczyniowych z powtarzalnymi, ilościowymi wynikami obrazowania do oceny związków.
- Analityka: Zapewnia odczyty strukturalne i perfuzyjne, które pozwalają na analizę porównawczą w różnych warunkach doświadczalnych.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia molekularne z efektami naczyniowymi w modelach przedklinicznych, wspierając ocenę skuteczności powiązaną z biomarkerami.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę obrazowania do fenotypowania naczyniowego w wielu obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w odpowiedziach naczyniowych.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację dzięki ustandaryzowanym protokołom perfuzji i obrazowania.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesne wykrywanie wad naczyniowych i redukując odrzuty na późnych etapach badań.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektów w oparciu o analizę ryzyka, w oparciu o ilościowe dane dotyczące morfologii naczyniowej i perfuzji.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikrochirurgicznej perfuzji naczyniowej i pracy z środkami kontrastowymi.
- Zależne od infrastruktury obrazowania mikro-CT oraz możliwości przygotowania środków kontrastowych.
- Wymaga standaryzacji ciśnienia perfuzji, czasu trwania oraz rozcieńczenia kontrastu pomiędzy zespołami w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Adaptacja w różnych systemach modelowych może wymagać korekt techniki kanulacji i parametrów perfuzji.
- Ograniczenia praktyczne obejmują wrażliwość na pęcherzyki powietrza, niepełną perfuzję oraz wymieszanie kontrastu, co może pogorszyć jakość wizualizacji.
