Pełna, kontra subregionalna kwantyfikacja obciążenia beta-amyloidem w wycinkach mózgu myszy

Protokół ten porównuje obciążenie blaszką amyloidowo-beta w pełnych sekcjach i podregionach zainteresowania w sekcjach mózgu transgenicznych myszy APP / PS1. Metoda i wyniki przedstawione w tym konkretnym protokole umożliwią czytelnikom lub badaczom wybór między pełnym regionem zainteresowania a analizą podregionu zainteresowania w celu określenia obciążenia beta w sekcjach mózgu myszy. Aby rozpocząć, pobierz oprogramowanie do analizy obrazu.

Po instalacji uruchom oprogramowanie i kliknij plik, a następnie otwórz i wybierz obraz do analizy. Na pasku narzędzi oprogramowania wybierz narzędzie proste i narysuj linię prostą wzdłuż długości podziałki liniowej. Kliknij analizę, a następnie kliknij zakładki ustaw skalę.

Ponownie kliknij kartę analizy, a następnie zmierz karty, aby zanotować długość lub odległość paska skali w pikselach. W wyskakującym okienku wprowadź odległość w pikselach, znaną odległość paska skali i wprowadź jednostkę długości jako mikrometr. Następnie zaznacz pole globalne, aby zastosować nowe ustawienie skali do wszystkich kolejnych obrazów, jeśli przetwarzanych jest wiele obrazów.

Kliknij przycisk OK, aby zastosować ustawienia. Aby ustawić żądany pomiar dla obszaru przekroju, przejdź do analizy, następnie ustaw pomiary i wybierz pola obszaru i wyświetl etykietę. Upewnij się, że analizowany obraz jest zaznaczony na karcie Przekieruj do.

Aby ułatwić wizualizację hipokampa lub kory mózgowej, przejdź do obrazu i dostosuj jasność lub kontrast. Przeciągnij maksymalny suwak stopniowo w lewo, aby zwiększyć przejrzystość tkanek, aż do zidentyfikowania obszarów mózgu będących przedmiotem zainteresowania lub ROI. Użyj narzędzia do zaznaczania wielokąta lub odręcznego, aby obrysować obszar hipokampa.

Po obrysowaniu regionu kliknij opcję resetowania ustawień jasności lub kontrastu, aby powrócić do oryginalnej jasności. Aby zmierzyć całkowitą powierzchnię tkanki w wybranym obszarze, kliknij edytuj i wyczyść na zewnątrz. Gdy wybrany region jest jedynym obrazem na ekranie, kliknij kartę analizy, a następnie zmierz, aby uzyskać całkowity obszar tkanki analizowany w wyskakującym okienku.

Następnie zapisz dane w pliku Excel. Aby zmierzyć zabarwiony obszar pozytywowy 6-E10, przejdź do kart obrazu, regulacji i progu koloru w kolejności. Gotowy filtr w ramach metody progowej zapewnia pożądane wyniki, podkreślając najsilniejsze sygnały na czerwono.

Po wybraniu odpowiedniego progu sprawdź ciemne tło, aby podświetlić plamki beta amyloidu na czarnym tle. Kliknij na wybór, a następnie oryginał i ponownie wybierz, podając ciemne sygnały osadów beta amyloidu na białym tle. Po wygenerowaniu wyskakującego okienka kliknij kartę analizuj i analizuj cząstki, a następnie naciśnij OK. Skopiuj dane wyjściowe podsumowania wygenerowane przez oprogramowanie, klikając przyciski edycji i kopiowania.

Następnie wklej do wcześniej uruchomionego pliku Excel z odpowiednimi etykietami. Oblicz procentowy obszar dodatni 6E-10 za pomocą wzoru Po pobraniu oprogramowania do analizy obrazu wykonuj kroki, aż ROI mózgu będzie możliwe do zidentyfikowania, jak pokazano wcześniej. Następnie, za pomocą narzędzia prostokąta, wybierz ROI w korze lub hipokampie.

Na pasku narzędzi kliknij edytuj, a następnie wybierz i określ zakładkę zmieniającą wysokość i szerokość na predefiniowaną wartość. Wyreguluj pudełko tak, aby było całkowicie pokryte chusteczką. Zresetuj jasność lub kontrast do oryginalnej jasności.

Zduplikuj wybrany zwrot z inwestycji, klikając pole prawym przyciskiem myszy i klikając duplikat. Otworzy się nowe okno z wybranym regionem. Zmień nazwę zduplikowanego obrazu, aby wyświetlić region, w którym się znajduje.

Dostosuj typ zduplikowanego obrazu, używając paska narzędzi i klikając obraz, a następnie wpisz klucze 8-bitowe, aby przekonwertować zduplikowany obraz RGB na 8-bitowy, aby jak najlepiej przeanalizować płytki. Odwróć obraz, klikając edytuj, a następnie odwróć. Aby zmierzyć obszar dodatni 6E-10, przejdź do obrazu, a następnie dostosuj i próg.

Predefiniowany filtr w ramach metody progowania zapewni pożądane wyniki, podświetlając najsilniejsze sygnały na czerwono. Po wybraniu odpowiedniego progu należy wcisnąć przycisk Zastosuj. Aby przeanalizować obszar dodatni 6E-10, użyj paska narzędzi i kliknij zakładki Analizuj i Analizuj cząstki, upewniając się, że wyniki podsumowania są zaznaczone.

Skopiuj dane wyjściowe podsumowania z obszarem procentowym, klikając karty edycji i kopiowania. Następnie wklej dane wyjściowe podsumowania do wcześniej uruchomionego pliku Excel z odpowiednimi etykietami. Powtórz procedurę dla różnych obszarów tkanki, upewniając się, że umieszczenie każdego pola w celu nakreślenia zwrotu z inwestycji jest spójne między każdym obrazem.

W tej reprezentatywnej ocenie porównano metody pełnej i podrzędnej analizy ROI w celu ilościowego określenia dodatniego obszaru 6E-10 w korze mózgowej i hipokampie. Pełna analiza ROI polega na nakreśleniu całego ROI. Z kolei analiza sub ROI polega na wybraniu predefiniowanego regionu w ramach ROI.

Procedura krokowa dla pełnej i sub ROI 6E-10 dodatniej kwantyfikacji obszaru, z rotacją ROI dla kwantyfikacji sub ROI, jest pokazana tutaj. Korelacja między pełną i podrzędną analizą ROI jest pokazana tutaj. Zaobserwowano istotną dodatnią korelację między obszarem dodatnim 6E-10 zgłoszonym przez dwóch czytelników wykonujących analizę sub ROI dla kory i hipokampa.

Co więcej, uśredniony obszar dodatni poniżej ROI 6E-10 miał silną, istotną dodatnią korelację z obszarem uzyskanym przy użyciu pełnego zwrotu z inwestycji. Dla średniego obszaru dodatniego 6E-10 w pełni w analizach sub ROI nie zaobserwowano istotnej różnicy w korze i hipokampie. Zaobserwowano istotną korelację między pomiarami homogenatu całego mózgu a rozpuszczalnym amyloidem beta 1-42 przez Elizę a pełną analizą ROI z badania Wybór progu jest kluczem do uzyskania dokładnej kwantyfikacji danych.

Wymagana jest interwencja użytkownika, aby upewnić się, że pozytywne plamy są dokładnie wybrane za pomocą wybranego filtra. Oprócz oznaczania ilościowego beta-amyloidu, metoda ta może być stosowana do innych fluorescencyjnych barwników immunologicznych. Na przykład Iba-1 z kwantyfikacji obszaru dodatniego mikrogleju.