Wysokorozdzielczy pomiar zachowań sterowanych węchem u larw Drosophila

Witajcie, nazywam się Matt Lui. Jestem pracownikiem postdoktorańskim w laboratorium Leslie Sal na Uniwersytecie Rockefeller. Dzisiaj chciałbym opowiedzieć Państwu o eksperymentach, które przeprowadzamy w celu zbadania chemotaksji larwalnej.

Problem, który nas interesuje, jest dość prosty. Został on przedstawiony w tej konfiguracji. Właśnie przeniosłem grupę larw *Drosophila* na tę powierzchnię agaru.

Środowisko to jest dość nieprzyjazne, a zwierzęta te są bliskie zagłodzenia. Zwierzęta te będą musiały w jakiś sposób odnaleźć drogą do najbliższego źródła pożywienia; tutaj znajdują się banany emitujące zapach, który przyciągnie larwy. Środowisko to nie jest idealne do badania zachowań chemotaktycznych, dlatego pierwszą ulepszeniem będzie zastąpienie banana substancją chemiczną.

Ta substancja chemiczna to octan izoamylu, który jest jednym z dominujących związków aromatycznych w bananie. Jest to nasz sztuczny aromat, dzięki któremu mamy znacznie lepszą kontrolę nad bodźcem węchowym. Kolejnym usprawnieniem jest zastosowanie zamkniętego środowiska, aby w ten sposób zapobiec fluktuacjom w rozprzestrzenianiu się substancji.

Oto test, którego używamy w laboratorium od bardzo długiego czasu. Jest to szalka Petriego z warstwą agaru na dnie. Agar jest idealny do badań nad chemotaksją larw, ponieważ utrzymuje ich nawilżenie.

Po obu stronach płytki znajduje się zakrętka wykonana z Teflonu; teraz wprowadzimy octan izoamylu na jedną stronę, a na drugą nie wprowadzimy żadnej substancji. Po wykonaniu tej czynności należy zamknąć płytkę Petriego, odczekać chwilę, aż substancja zdyfunduje, a następnie otworzyć płytkę. Wprowadzamy tutaj zwierzę i pozwalamy mu poruszać się przez określony czas.

Ten test opiera się na założeniu, że poprzez wprowadzenie theodoru na jedną stronę płytki powstaje gradient, który ustala się dość szybko i pozostaje stabilny przez cały okres badania. Głównym problemem jest jednak fakt, że nikt dotąd nie wykazał, aby gradient ten faktycznie istniał w płytce. Możliwe jest, że wkrótce po dodaniu theodoru następuje jego jednorodny rozkład w płytce, co skutkuje bardzo niewielkim nachyleniem gradientu, lub że do ustalenia się gradientu wymagane są kilka minut.

Będzie to oczywiście zależeć głównie od ciśnienia par stosowanego eteru. Druga kwestia wiąże się z tym, co jest kwantyfikowane podczas eksperymentu. Wyobraźmy sobie, że zwierzę startuje z tego miejsca, oznaczonego X, a po trzech minutach zostaje znalezione przy przeciwległej płytce końcowej, oznaczonej czerwonym X. W tej sytuacji istnieją dwa możliwe podejścia.

Jedną z możliwości jest rejestrowanie wyłącznie końcowej pozycji zwierzęcia po określonym czasie, na przykład trzech lub pięciu minutach. Wówczas jedynymi przechwyconymi informacjami byłyby pozycja startowa i końcowa, jednak uważamy, że istotne jest uzyskanie dobrej rozdzielczości w odniesieniu do zachowania zwierzęcia w czasie. Przykładowo, zwierzę mogło niemal w ogóle nie oddalić się od pozycji startowej do końcowej, tak jak tutaj, lub mogło przez znaczną część czasu przebywać w obszarze wokół theodor, a następnie powrócić tam przed zakończeniem próby.

Wnioski, jakie wyciągnęlibyśmy z tych dwóch sytuacji, są zupełnie inne. W jednym przypadku zwierzę mogło nie zareagować na bodziec, podczas gdy w drugim z pewnością zareagowało. Dwie ulepszenia, których staramy się dokonać, to po pierwsze kontrola kształtu i stabilności drugiego gradientu w arenie.

Po drugie, śledź w czasie rzeczywistym zachowanie zwierzęcia i zapisuj wszystkie te informacje. W następnej sekwencji Sylvia zaprezentuje sposób przygotowania rozcieńczeń seryjnych. Nazywam się S ti.

Jestem asystentem badawczym w laboratorium VAs, pracującym nad materiałem lui. Dzisiaj pokażę Państwu, jak przygotować materiały do systemu komór, którego używamy do śledzenia zwierząt. Głównym problemem w naszym systemie komór jest to, że wykorzystujemy zapach rozproszony w powietrzu.

Oznacza to na przykład, że jeśli stosowane przez nas płytki agarowe nie są płaskie, mogą wystąpić wahania stężenia pomiędzy eksperymentami, co wprowadzi szum do systemu. Przedstawię zatem kilka praktycznych wskazówek, które pomogą zredukować szum w systemie. Materiały niezbędne do przygotowania rozcieńczenia zapachu to słoik szklany, najlepiej z ciemnego szkła w przypadku stosowania zapachów reaktywnych na światło, oraz aliquot zapachu, który jest przedmiotem badania.

Pipety szklane do przygotowania tej porcji oraz odpowiednia mechaniczna pompka do pipet. Następnie końcówki do pipet z olejem parafinowym, standardowa pipeta automatyczna oraz małe fiolki do rozcieńczania. Podkreślam, że fiolki muszą być szklane i najlepiej ciemne, a dodatkowo waga do wykonywania dokładnych pomiarów i ograniczania zmienności między eksperymentami.

Z uwagi na wysoką lotność zapachów oraz fakt, że niektóre z nich są toksyczne, procedury te przeprowadza się pod dygestorium. Pierwszym krokiem przy przygotowywaniu rozcieńczenia zapachu jest odmierzanie odpowiedniej porcji substancji zapachowej, która ma zostać rozcieńczona. Aby przygotować dokładne rozcieńczenia i zminimalizować różnice między eksperymentami, konieczne jest ważenie wszystkich składników.

Zacznij od etykietowania; przygotujemy roztwór maślanu etylu o stężeniu 1 M. Najpierw przygotuj olej parafinowy. Olej parafinowy jest bardzo lepki, dlatego ważne jest, aby zanurzać końcówkę pipety w nim w jak najmniejszym stopniu – tylko tak głęboko, aby móc pobrać olej bez tworzenia pęcherzyków powietrza.

Następnie warto wytrzeć nadmiar oleju parafinowego z boku butelki. Ponownie przypominamy, że ze względu na wysoką lepkość oleju parafinowego, bardzo ważne jest powolne jego dozowanie do fiolki. Po upipetowaniu oleju parafinowego do butelki nie wyrzucaj od razu końcówki, ponieważ na jej dnie może zebrać się jeszcze więcej cieczy.

Warto przygotować arkusz obliczeń przed rozpoczęciem rozcieńczania, w którym wcześniej wyliczy się objętość i wagę dodawanego oleju parafinowego, a następnie zrobić to samo w przypadku substancji zapachowej, uwzględniając jej wagę. W ten sposób na wadze można sprawdzić, czy dysponuje się odpowiednią ilością oleju parafinowego oraz substancji zapachowej. W razie potrzeby należy dolać więcej oleju parafinowego i ponownie zważyć go, aż do uzyskania właściwej masy.

Gdy uzyskają Państwo prawidłową wagę oleju bazowego, należy dodać substancję zapachową, stosując te same zasady. Dobrze. Teraz pokażę, jak przygotować larwy do śledzenia.

Zazwyczaj wykorzystujemy larwy w wieku sześciu dni. Robimy to, ponieważ są one wystarczająco duże, aby oprogramowanie mogło je łatwo wykryć, a jednocześnie pozostają bardzo aktywne. Aby sprawdzić, czy larwy są zbyt stare do śledzenia, należy sprawdzić, czy wspinają się one po ściankach. Jeśli larwy wspinają się po ściankach, oznacza to, że są zbyt stare i nie będą szczególnie aktywne.

Pierwszym krokiem w przygotowaniu larw jest zanurzenie ich w 15% sacharozy. Powodem stosowania 15% sacharozy jest to, że larwy będą unosić się w tym roztworze, natomiast pokarm albo częściowo w nim rozpuści się, albo opadnie na dno. Należy nalać tyle sacharozy, aby poziom cieczy znajdował się około nieco mniej niż cal od górnej krawędzi butelki lub fiolki.

Następnie należy użyć szpatułki. Larwy powinny być już widoczne na powierzchni; delikatnie zagrzebujemy w pożywce, aby wydobyć zwierzęta zagrzebane w podłożu, lekko mieszamy, by oddzielić je od pożywki, a następnie odstawiamy całość na kilka minut. Gdy pożywka i larwy zostaną odpowiednio rozdzielone, należy wziąć wcześniej opisaną szalkę Petriego i przelać zawartość do jej głębszej części.

Zachowaj pokrywkę szalki Petriego, ponieważ zostanie ona napełniona wodą i będzie służyć jako naczynie dla śledzonych larw, co pozwoli oddzielić osobniki już przeanalizowane od tych, które nie zostały jeszcze poddane śledzeniu. Po przelaniu larw do szalki Petriego należy odczekać 30 minut, aby mogły one zaadaptować się do sacharozy i osiągnąć stan głodówki. Dzięki temu larwy będą wykazywać lepsze zachowanie w układzie do śledzenia po upływie tych 30 minut czasu adaptacji.

Czas dodawania sacharozy to dobry moment na przygotowanie płytek do śledzenia. Są to pokrywy do płytek 96-dołkowych. Można je kupić oddzielnie; tutaj mamy roztwór agarozy 3%, który został już podgrzany.

Stosujemy stężenie 3%, ponieważ zapobiega ono drążeniu przez larwy, a jednocześnie jest na tyle gęste, aby mogły po nim chodzić i pozostawały nawilżone na powierzchni każdej płytki. Należy pipetować 25 ml agarozy. Ważne jest, aby starać się unikać powstawania dużych pęcherzyków powietrza w żelu.

Ważne jest również umieszczenie płytek na płaskiej powierzchni, w przeciwnym razie żele mogą być nachylone, co może wpłynąć na zachowanie larw. Po zastygnięciu żelu przykrywamy płytki i owijamy folią spożywczą, aby zapobiec ich wysychaniu. Dzięki temu zostaną one zachowane w dobrym stanie do śledzenia przez kilka dni.

W tej sekwencji przedstawię Państwu nasz test behawioralny, który nieco różni się od testu w szalce Petriego, o którym wspomniałem wcześniej. Będą Państwo potrzebować płytek 96-dołkowych oraz tych zawierających warstwę agarową. Testy składają się z trzech ułożonych jeden na drugim przykrywek.

Pierwsza warstwa jest pusta i służy jedynie do izolacji układu od powierzchni, na której spoczywa. Druga warstwa zawiera powierzchnię Diego agro. W tym miejscu zwierzęta zostaną umieszczone na powierzchni, a następnie, jak pokażę w kolejnym kroku, wprowadzimy theodor do płytki.

Ważne jest, aby przy każdym ładowaniu theodor używać nowej i świeżej pokrywki. Ma to na celu zapobieganie kontaminacji między poszczególnymi eksperymentami. Będą Państwo również potrzebować innego rozcieńczenia.

Zazwyczaj nie używamy barwnika do nakładania DNA, ale w tym przypadku posłużę się nim w celach ilustracyjnych. Jest to wysokie stężenie DNA. Podczas gdy ta próbka jest bardzo rozcieńczona, moim celem będzie stworzenie gradientu wzdłuż linii.

W tej linii chcemy uzyskać wzrost stężenia z lewej strony na prawą. Aby to osiągnąć, użyję kilku kropel w określonej kolejności, umieszczonych w pierścieniu kondensacyjnym o rosnącym stężeniu. Zaczynam od najwyższego stężenia, które zostanie umieszczone na krańcu.

Ważne jest, aby rozprowadzić je w obrębie pierścienia. Teraz przechodzę do kolejnego stężenia, które jest dwukrotnie mniejsze od pierwszego, i nanoszę je do tego pierścienia. Zatem nie, mam sześć kropel.

Pierwsza z nich zawiera stężenie wynoszące na przykład 1. Druga ma stężenie 0,5, czyli dwukrotnie mniejsze niż pierwsza. Trzecia ma stężenie 0,25 i tak dalej.

Otrzymaliśmy szereg geometryczny wzdłuż linii. Następny krok polega na odwróceniu tej pokrywki na powierzchni AAL, dzięki czemu pod wpływem napięcia powierzchniowego wszystkie kropelki pozostają zawieszone u górnej krawędzi pokrywki. Opracowaliśmy technikę opartą na spektroskopii w podczerwieni, aby zmierzyć całkowite stężenie w płytce.

Stosując tę technikę, mogliśmy wykazać, że w przypadku zastosowania szeregu geometrycznego wzdłuż linii substancji zapachowej, uzyskuje się stężenie zapachu wzdłuż jej długości, które wzrasta wykładniczo, jak pokazano tutaj, natomiast wzdłuż szerokości płytki otrzymujemy profil z maksimum znajdującym się bezpośrednio pod linią substancji zapachowej. Oto jak wygląda rzeczywista geometria gradientu.

Biorąc pod uwagę stężenie teodoru w powietrzu, istotne jest, że udało nam się wykazać, iż geometria gradientu pozostaje stabilna przez co najmniej 15 minut. Po założeniu górnej pokrywy czekamy 30 sekund, aby gradient mógł się ustabilizować. Następnie wprowadzamy zwierzę do areny.

Zwierzę zostaje wprowadzone pod linię drugiego końca między pozycją trzecią a czwartą; używamy małej szpilki, aby przenieść larwy z roztworu sacharozy na powierzchnię agaru. Przeniesienie odbywa się poprzez przechwycenie larwy głowicą szpilki. Szybko otwieramy pokrywkę i umieszczamy larwę na powierzchni agaru.

Następnie zamykamy pokrywę. Ważne jest, aby zminimalizować czas, w którym pokrywa pozostaje otwarta. Kolejno rejestruje się ruch zwierzęcia przez trzy lub pięć minut.

Przeprowadzono właściwe nagrywanie. W tej konfiguracji śledzenia wykorzystano kamerę podłączoną do komputera. Do zbierania informacji o ruchu zwierzęcia i zapisywania ich w formie pliku cyfrowego zastosowano oprogramowanie do śledzenia obrazu Aton vision firmy Nordis.

Przystępujemy teraz do eksperymentu behawioralnego. Mamy pokrywkę z warstwą agarową oraz rozcieńczenia.

Diego utknął na pierwszej nakrętce. Przed nałożeniem teodoru ważne jest, aby wymieszać każdą probówkę w wortexie. Używamy naszych rozcieńczeń, przy czym najmniejsze znajduje się po lewej stronie, a największe tutaj po prawej.

Wszystkie sześć kropel zostanie naniesionych na płytkę w tym samym czasie. Aby zapobiec utracie zapachu, stosujemy tutaj pipetę wielokanałową; z każdej próbki rozcieńczenia pobiera się 10 µL zapachu, a następnie nanosi go jednocześnie. Po naniesieniu pokrywkę odwraca się na powierzchni agros.

Gradient został utworzony na płytce w ciągu ostatnich 30 sekund, tak jak pokazałem wcześniej. Teraz wprowadzam zwierzę na powierzchnię dielektryczną. W momencie wprowadzenia zwierzęcia rozpoczynam nagrywanie.

Zwierzę znajduje się w obszarze badawczym, a jego ruch jest obecnie śledzony. Jak widać, zwierzę podąża wzdłuż linii substancji zapachowej i zmierza w stronę punktu o najwyższym stężeniu gradientu. Należy pamiętać, że stężenie wzrasta od lewej do prawej strony w sposób wykładniczy.

Jak widać, kierunek ruchu jest stale korygowany. W odniesieniu do bodźca zwierzę osiągnęło teraz punkt najwyższego stężenia gradientu, po czym usuwamy je z płytki. Zwierzę zostaje przeniesione na inną płytkę, aby mieć pewność, że nie śledzimy tego samego osobnika dwukrotnie bezpośrednio.

Po wprowadzeniu nowej larwy i rozpoczęciu nowego nagrania, stosujemy następujące zasady śledzenia. Śledzenie zostaje przerwane w momencie, gdy zwierzę dotrze do rzędu płytki o najwyższym stężeniu, czyli do tego tutaj i tego. Ponadto, jeśli zwierzę uderzy w ściankę, śledzenie jest przerywane, aby uniknąć jakichkolwiek zakłóceń.

Pierwsze pytanie, na które szukaliśmy odpowiedzi, było dość proste. Chcieliśmy dowiedzieć się, czy zwierzę jest w stanie wyczuć dany zapach przy określonym stężeniu. Aby przeprowadzić taki test, zazwyczaj stosujemy pojedyncze źródło zapachu zamiast kilku.

Pozwala to na zachowanie jednego stopnia swobody w zmianie stężenia w kropli zapachowej. Tutaj, na przykład, mamy kroplę o wysokim stężeniu, a tutaj kroplę o niskim stężeniu. Zazwyczaj wprowadzamy zwierzę na powierzchnię agaru bezpośrednio pod kroplą zapachową i sprawdzamy, czy zwierzę jest w stanie wykryć jej obecność i pozostać w jej sąsiedztwie.

Teraz chciałbym zaprezentować bardziej zaawansowane zastosowanie naszego testu. Wyobraźmy sobie, że mamy jedną kropelkę z uporządkowanym układem, w której zarejestrowano kilka nałożonych na siebie trajektorii – tutaj mamy trzy takie ścieżki. Jedna z nich, zaznaczona na zielono, została wygenerowana przez pojedynczą jednostkę.

Mamy tutaj pomarańczowy ślad, który jest mniej scentrowany, oraz różową trajektorię, która reprezentuje zwierzę krążące wokół źródła. Uważamy, że istnieje wiele informacji na temat szczegółów tych trajektorii. Z tego powodu importujemy trajektorię jako serię pozycji do programu MATLAB i przeprowadzamy analizę za pomocą tego oprogramowania.

Oto odległość od źródła, prawdopodobnie w funkcji czasu. W przypadku trzech wcześniej wyświetlonych trajektorii mamy trajektorię zieloną, która pozostaje bardzo blisko źródła, oraz trajektorię pomarańczową, która wykazuje znacznie większy poziom szumów.

Następnie mamy tę fioletową trajektorię, która interesująco wykazała, że zwierzę oddaliło się od źródła, aby pozostać w pewnej odległości, co prawdopodobnie odpowiadało optymalnemu stężeniu. Tutaj widać ilustrację 10 trajektorii zwierząt, które nie są w stanie wyczuć zapachu. Są to mutanty lub mutanty three B, które nie reagują na zapach.

Jak widać, wszystkie te trajektorie ilustrują, że zwierzęta nie zdołały wykryć źródła zapachu i po prostu je opuściły. W przeciwieństwie do tego, zarejestrowaliśmy tutaj 10 kolejnych trajektorii dla zwierząt typu wild-type. Zwierzęta te oczywiście potrafią węchać i, jak widać, wszystkie z nich gromadzą się bezpośrednio pod źródłem zapachu.

Przedstawione 20 trajektorii zostało w rzeczywistości uzyskanych bez znajomości tożsamości zwierząt. Dowodzi to wydajności i wiarygodności naszego testu. Aby ustalić, czy niektóre Mutanty są w stanie wyczuć zapach w gradiencie wykładniczym, generujemy kilka ścieżek, chcąc ocenić, jak dobrze zwierzęta są w stanie podążać w kierunku bodźca znajdującego się na drugim końcu.

Pokażę teraz 15 osobno zarejestrowanych trajektorii i, jak widać, zwierzęta bardzo dobrze podążały za bodźcem znajdującym się na przeciwległym końcu linii. Teraz przejdziemy do prostego badania kontrolnego. Może się zdarzyć, że zwierzęta w gradiencie wykładniczym podążały wzdłuż linii dlatego, że obecny był jakiś bodziec, niezależnie od jego stężenia, a zwierzęta po prostu poruszały się w linii prostej.

Aby zatem wykazać, że w rzeczywistości obliczają one stężenie lub parametr z nim powiązany i wykorzystują go do kierowania swoim ruchem, zastosowaliśmy geometrię przypominającą kształtem dach. Larwa jest wprowadzana tutaj w zwykły sposób i oczekujemy, że poruszy się wzdłuż linii, a następnie wykryje spadek stężenia po tym punkcie i do niego powróci. Test przeprowadzono na pięciu osobnikach.

Zebraliśmy trajektorie, a teraz przedstawiamy je nałożone na ten slajd. Jak widać, zwierzęta wystartowały z tego miejsca, przemieściły się wzdłuż linii, następnie zbadały obszar odpowiadający najwyższemu stężeniu i głównie w nim pozostały. Silnie sugeruje to, że są one w stanie obliczyć różnicę stężeń w czasie rzeczywistym, korzystając z testu z pojedynczym źródłem.

Byliśmy w stanie postawić przede wszystkim jedno kluczowe pytanie: czy zwierzę jest w stanie wykryć zapach przy określonym stężeniu, korzystając z urządzenia wieloźródłowego? Dzięki temu zyskaliśmy większą elastyczność w modyfikowaniu kształtu gradientu oraz w określaniu, czy zwierzę jest w stanie wykorzystać te informacje.

Chciałbym zilustrować tę koncepcję, przeprowadzając prosty eksperyment. W gradientach, które do tej pory przygotowaliśmy, kształt wzdłuż soczewki był wykładniczy. Teraz pytanie brzmi: czy jeśli utrudnimy zadanie komórkom, wprowadzając liniowy wzrost stężenia wzdłuż soczewki, nadal będą one w stanie dotrzeć do przeciwległej linii końcowej?

Ten wykres przedstawia dwa rodzaje gradientu. Przetestowaliśmy gradient wykładniczy zaznaczony na fioletowo oraz gradient liniowy zaznaczony na zielono. Jest to gradient liniowy; wypiszę teraz różne stężenia octanu isamu rozcieńczonego w oleju paren.

Jest to szereg arytmetyczny. Mamy liniowy gradient, który zostanie utworzony, a jak widać, jego nachylenie jest dość niewielkie w porównaniu z gradientem wykładniczym, gdzie stężenie na końcach również wynosi 0,5, ale wzrasta do 0,03. Pytanie brzmi, czy navi są w stanie przeprowadzić chemotaksję, gdy mierzą się z tak niewielkim gradientem?

Tutaj przedstawiono rzeczywiste stężenie octanu zastosowane w sześciu kroplach dla gradientu wykładniczego oraz dla gradientu liniowego. Jak widać, mimo że najwyższe stężenia są w obu przypadkach takie same, w przypadku gradientu liniowego najniższe stężenie jest stosunkowo wysokie. Przeprowadziliśmy eksperyment z gradientem liniowym; przedstawiono tutaj 15 trajektorii osobników typu dzikiego i uważamy, że jest dość jasne, iż zwierzęta te były w stanie wykryć gradient liniowy i podążać za tym sygnałem wzdłuż linii gradientu.

Sądzę, że nasz przekaz jest jasny. Zanim zakończymy, chciałbym krótko omówić przyszłe kierunki rozwoju tego układu śledzenia. Chociaż ta konfiguracja pozwala na realizację wielu interesujących zadań, na przykład obserwację złożonych zachowań larw w większej skali i przez dłuższy czas, posiada ona pewne ograniczenia.

Na przykład, ograniczeniem jest rozmiar płytki, co z kolei determinuje czas trwania śledzenia oraz zakres złożonych zachowań, które można analizować. W związku z tym korzystne byłoby opracowanie systemu, w którym płytka byłaby większa lub w ogóle nie istniałyby ograniczenia wynikające z jej krawędzi. Kolejnym problemem jest to, że przy obecnym oprogramowaniu trudne jest jednoczesne śledzenie więcej niż jednego zwierzęcia, co uniemożliwia obserwację zachowań populacyjnych w czasie rzeczywistym.

Kolejnym interesującym aspektem zachowania, którego nie możemy przetestować za pomocą tej aparatury, są rzeczywiste trójwymiarowe ruchy larw w przestrzeni. Śledząc zwierzęta, zauważą Państwo na przykład, że po dotarciu do kropli zapachu mogą one unosić głowę lub poruszać nią na boki, próbując wykryć zmiany w stężeniu. Prawdopodobnie nie jest to obecnie możliwe przy zastosowaniu naszej konkretnej konfiguracji, dlatego warto byłoby opracować rozwiązanie, które pozwoliłoby na przeprowadzenie takich obserwacji.