Jednoczesne obrazowanie i wykrywanie za pomocą cytometrii przepływowej wielu fluorescencyjnych markerów starzenia w starczych komórkach nowotworowych wywołanych terapią
12 lipca 2022
Tutaj prezentujemy metodę opartą na cytometrii przepływowej do wizualizacji i kwantyfikacji wielu markerów związanych ze starzeniem się w pojedynczych komórkach.
Metoda ta może szybko generować obrazy o wysokiej rozdzielczości, które umożliwiają analizę rozkładu przestrzennego i kwantyfikację sygnałów fluorescencyjnych w komórkach, umożliwiając jednocześnie szybką analizę wielu próbek. Komórki są mierzone za pomocą zaawansowanego systemu obrazowania cytometrii przepływowej, łączącego szybkość, czułość i szczegółowe obrazy pojedynczych komórek z informacjami przestrzennymi, dostarczając unikalnych danych, których nie można uzyskać za pomocą optometrii przepływowej lub mikroskopii. Jedną z ważnych rad jest zapewnienie wystarczającej liczby komórek do ustalenia ustawień przyrządu i zawieszamy komórki o dużej gęstości na czas pomiarów.
Poza tym pozyskiwanie danych jest proste i podobne do konwencjonalnej cytometrii przepływowej. Najpierw wygeneruj linie komórkowe DLBCL zgodnie z opisem w manuskrypcie. Następnie dodać 10 milimolowy roztwór EdU w stosunku jeden do 1000 do hodowli komórkowej DLBCL i inkubować płytkę w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny po wymieszaniu płytki przez delikatne kołysanie.
Po inkubacji wyjąć płytkę i dodać 100 milimolowy roztwór chlorochiny do końcowego stężenia 75 mikromolowych. Wymieszaj, delikatnie kołysząc i inkubuj przez 30 minut. Następnie dodać 20 milimolowych roztworów C12 FDG do końcowego stężenia 20 mikromolów.
Po delikatnym wymieszaniu inkubować płytkę przez godzinę, jak pokazano wcześniej. Następnie dodaj 100 milimolowy roztwór 2-fenyloetylo-beta-d-d-tiogalaktozydu w stężeniu od jednego do 50, aby zatrzymać barwienie beta-galu FSA. I delikatnie obróć płytkę, aby wymieszać.
Przenieś komórki do sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 15 mililitrów i wiruj z prędkością 100 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu przemyć komórki czterema mililitrami PBS i odwirować w temperaturze 100 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie ponownie zawiesić granulki komórkowe w 500 mikrolitrach w 4% roztworze utrwalającym paraformaldehyd.
Po 10 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej odwirować w temperaturze 250 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić sklarowany osad i przemyć komórki dwukrotnie czterema mililitrami PBS i odwirować w temperaturze 100 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po umyciu wyrzuć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 mikrolitrach buforu do przepuszczalności saponin.
Teraz przenieś zawiesinę do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Osadzać komórki w temperaturze 250 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie zawiesić komórki w 200 mikrolitrach roztworu przeciwciała pierwotnego i inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, w ciemności.
Odwirować probówki w temperaturze 250 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wyrzucić supernatant i przemyć 100 mikrolitrami roztworu saponinowego. Po dwukrotnym umyciu komórek wyrzuć supernatant i ponownie zawieś granulki komórek w 500 mikrolitrach koktajlu detekcyjnego EdU.
Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności i wirować w temperaturze 250 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Wyrzucić supernatant i przemyć jednym mililitrem roztworu saponinowego. Powtórzyć mycie dwa razy, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek w 20 do 50 mikrolitrach PBS.
Przed włączeniem przyrządu opróżnij butelkę ze zużytym płynem i sprawdź poziom SpeedBeads, sterylizatora, środka czyszczącego, odbąbelkowca i wystarczającej ilości płynów. Po włączeniu przyrządu i oprogramowania do obrazowania kliknij przycisk uruchamiania, aby zainicjować fluidykę i kalibrację systemu. Ustaw powiększenie na 40 razy i ustaw prędkość płynu na niską.
Po włączeniu laserów włącz laser o długości 405 nanometrów do pomiaru EdU Pacific Blue, 488 nanometrów do pomiaru C12-FDG oraz 642 nanometry do pomiaru Alexa-Fluor-647-gamma-H2AX. Ustaw kanał szósty dla kanału rozproszonego, kanał pierwszy i kanał dziewiąty dla jasnego pola. Następnie zacznij od próbki, która ma mieć najwyższą fluorescencję, aby ustawić intensywność laserów i delikatnie odwróć probówkę z próbką, aby wymieszać.
Po otwarciu pokrywy probówki włóż probówkę z próbką do stacji dokującej. Kliknij Załaduj, aby rozpocząć i otworzyć wykres punktowy. Następnie wybierz obszar Cechy, podkreślenie MO1 i podkreślenie współczynnika proporcji MO1 odpowiednio dla osi X i Y.
Ustaw współczynnik proporcji bramki powyżej 0,5, aby wykluczyć dublety i agregacje komórek poniżej i po prawej stronie oraz populację SpeedBead po lewej stronie. Teraz otwórz wykres histogramu i wybierz średni kwadrat gradientu cech maski pierwszej i kanał pierwszy dla osi X. Wybierz populację singletów i ustaw bramkę, aby wybrać dla skoncentrowanych komórek.
Otwórz wykres histogramu i wybierz nieprzetworzone maksymalne intensywności pikseli dla kanałów osi X 2, 7 i 11. Następnie dostosuj moce laserów 488 nanometrów, 405 nanometrów i 642 nanometrów odpowiednio dla kanału drugiego, siódmego i 11, tak aby każdy fluorochrom miał surową maksymalną wartość piksela między 100 a 4 000, aby uniknąć przesycenia. Wybierz skoncentrowaną populację do zarejestrowania i kliknij przycisk Pobierz, aby zmierzyć próbki DLBCL ze spójnymi ustawieniami.
Zmieniając próbki do pomiaru, kliknij przycisk powrotu, aby odzyskać probówkę z próbką. Naciśnij przycisk Załaduj, aby wyrzucić próbkę. Po zmierzeniu wszystkich próbek wyłącz jasne pole i laser rozproszony
.Zmierz pojedyncze próbki kontrolne koloru, aby wygenerować macierz kompensacji. Kliknij przycisk Shutdown (Zamknij), aby zamknąć system obrazowania. Przeanalizuj dane w oprogramowaniu do analizy obrazu.
Użyj narzędzia Spot Wizard w oprogramowaniu do analizy obrazów, aby automatycznie zliczyć i określić ilościowo ogniska jądrowej gammy H2AX i obrazy żywych komórek. Wybierz dwie populacje komórek, jedną z wysoką i jedną z niską liczbą plamek, aby przeszkolić Kreatora lokalizacji w celu dalszej automatycznej analizy zliczania plamek. Metoda cytometrii przepływowej w obrazach pojedynczych komórek wykazała zwiększoną populację C12-FDG dodatnią, ujemną EdU, gamma H2AX-dodatnią, starzejącą się populację i KARPAS422.
Komórki WSU-DLCL2 i OCI-LY1, ale nie w komórkach SU-DHL6. Analiza oparta na obrazowaniu wykazała znacznie wyższą liczbę ognisk i KARPAS422 gamma H2AX, WSU-DLCL2 i OCI-LY1, ale nie w komórkach SU-DHL6. Podobne wyniki uzyskano w odniesieniu do częstości występowania i danych ilościowych.
Dodanie saponiny do zawiesiny komórkowej ma kluczowe znaczenie, w przeciwnym razie przeciwciała nie mogą dotrzeć do wewnętrznych antygenów komórki, a ostre detergenty prowadzą do utraty sygnału C12-FTG Cytometria obrazowa jest optymalna do analizy zmian w lokalizacji markerów, takich jak translokacja czynnika transkrypcyjnego do jądra w odpowiedzi na określone bodźce. Taką analizę można również przeprowadzić za pomocą naszego protokołu. Metoda ta pozwala na wizualizację wielu markerów fluorescencyjnych na poziomie pojedynczej komórki, co pomaga w wykryciu obecności, intensywności i lokalizacji poszczególnych sygnałów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia opartą na cytometrii przepływowej metodę wizualizacji i kwantyfikacji wielu markerów związanych z procesem starzenia się w pojedynczych komórkach. Metoda ta umożliwia szybkie generowanie obrazów o wysokiej rozdzielczości oraz analizę rozkładu przestrzennego i kwantyfikację sygnałów fluorescencyjnych wewnątrz komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Cytometria przepływowa
- Starzenie komórkowe
Wstęp
- Cytometria przepływowa jest potężnym narzędziem do analizy populacji komórek.
- Zaawansowana obrazująca cytometria przepływowa łączy w sobie szybkość i czułość.
- Zrozumienie markerów związanych ze starzeniem się komórek jest kluczowe dla wielu badań biologicznych.
- W celu optymalnego ustawienia instrumentu zaleca się stosowanie zawiesiny komórkowej o wysokiej gęstości.
Cel badania
- Opracowanie metody analizy wielu markerów starzenia w pojedynczych komórkach.
- Poprawa rozdzielczości i szybkości pozyskiwania danych w cytometrii przepływowej.
- Dostarczenie unikalnych danych, których nie są w stanie zapewnić tradycyjne metody.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie zaawansowanego systemu obrazującej cytometrii przepływowej.
- Przygotowanie linii komórkowych DLBCL zgodnie z opisem w manuskrypcie.
- Dodanie roztworu EdU do hodowli komórkowej.
- Inkubacja komórek w kontrolowanym środowisku w celu uzyskania optymalnych wyników.
Główne wyniki
- Pomyślnie uzyskano obrazy komórek o wysokiej rozdzielczości.
- Przeprowadzono precyzyjną kwantyfikację sygnałów fluorescencyjnych.
- Skutecznie przeanalizowano rozmieszczenie przestrzenne markerów starzenia.
- Metoda wykazała wysoką wydajność w przetwarzaniu wielu próbek.
Wnioski
- Opracowana metoda usprawnia analizę markerów starzenia.
- Stanowi ona znaczący postęp w stosunku do tradycyjnej cytometrii przepływowej.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować szersze konteksty badań biologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Jednoczesne obrazowanie i detekcja wielu markerów starzenia z wykorzystaniem cytometrii przepływowej umożliwiają szybką, ilościową ocenę starzenia indukowanego terapią w populacjach komórek nowotworowych. Możliwość ta wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego oraz zwiększa pewność predykcyjną w kluczowych punktach zwrotnych fazy odkrywania i translacji. Integracja wysokoprzepustowej analizy pojedynczych komórek w procesach onkologicznych usprawnia walidację celów terapeutycznych i dostarcza danych niezbędnych do podejmowania decyzji portfelowych z uwzględnieniem ryzyka.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę szlaków starzenia komórkowego po interwencji chemioterapeutycznej.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez ilościowe oznaczanie markerów związanych ze starzeniem na poziomie pojedynczych komórek.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez odróżnienie starzenia od apoptozy w leczonych komórkach nowotworowych.
- Zwiększa pewność prognostyczną w procesie selekcji i triage'u kandydatów.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane testy multipleksowe do wysokoprzepustowego screeningu związków w modelach onkologicznych.
- Standaryzuje detekcję SA-β-gal, EdU oraz γH2AX w celu uzyskania powtarzalnych, ilościowych wyników.
- Umożliwia skalowalne odczyty wielomarkerowe wspierające wydajne procesy screeningu.
- Zapewnia wiarygodne dane dotyczące skuteczności związków i profilowania mechanistycznego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ujednolica wykrywanie markerów starzenia z modelami istotnymi dla przebiegu choroby w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Wspiera opartą na biomarkerach walidację przedkliniczną strategii terapeutycznych celujących w starzenie się komórek.
- Ułatwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektów z uwzględnieniem analizy ryzyka na podstawie ilościowych profili starzenia.
- Usprawnia predykcyjną redukcję ryzyka w procesie wdrażania kandydatów na późnych etapach badań.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta łączy wczesne etapy odkrywania, przesiewania i badań translacyjnych, umożliwiając multipleksową, ilościową analizę starzenia się komórek w modelach nowotworowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków dla mechanizmów starzenia indukowanego terapią.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki wielomarkerowe w celu przygotowania testów.
- Analityka: Zapewnia pomiary jednokomórkowe o wysokiej rozdzielczości oraz lokalizację przestrzenną markerów fluorescencyjnych.
- Badania translacyjne: Łączy ilościowe oznaczanie markerów starzenia z walidacją modeli przedklinicznych i dopasowaniem biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do multipleksowej detekcji starzenia w programach onkologicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad starzeniem się komórek.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje detekcję multipleksową i usprawnia pozyskiwanie danych o wysokiej zawartości (high-content data).
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne zarządzanie portfelem kapitałowym.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów w obszarze onkologii.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie cytometrii przepływowej z obrazowaniem oraz opracowywania analiz wielomarkerowych.
- Wymaga zaawansowanej aparatury i wydajnego oprogramowania analitycznego do analizy obrazów pojedynczych komórek.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów bramkowania, kompensacji i kwantyfikacji markerów pomiędzy zespołami.
- Adaptacja w różnych modelach nowotworowych może wymagać optymalizacji specyficznej dla danego markera.
- Utrata sygnału lub dostępność markerów mogą być zależne od warunków permeabilizacji i barwienia.
Często zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:55
Stain DLBCL Cells with Different Senescence Markers
4:01
Imaging Senescence Markers Using the Imaging Flow Cytometer System
7:12
Results: Visualization and Quantification of Senescent Cells on a Single-Cell Level
8:01
Conclusion
