Standaryzowany protokół przedanalityczny do biopsji płynnej do dalszych zastosowań DNA wolnych od krążenia

Jest to standardowy protokół przetwarzania i przechowywania próbek krwi do dalszych zastosowań w płynnej biopsji opartej na krążącym wolnym DNA. Jest to pierwszy opublikowany standardowy protokół, chociaż technika ta jest stosowana od kilku lat. Jest łatwy do naśladowania dzięki standardowemu wyposażeniu dostępnemu w większości laboratoriów translacyjnych lub naukowych.

Protokół może być wykonany przez cały personel laboratorium. Protokół pomaga ustandaryzować sposób pobierania i przechowywania próbek, co ostatecznie wpłynie na sytuację kliniczną i zmniejszy zmienność między różnymi ośrodkami wykonującymi tę samą lub podobną analizę na dalszych etapach, gdzie precyzja ma ogromne znaczenie. Metoda ta jest szczególnie przydatna w badaniach onkologicznych, a także w zastosowaniach klinicznych.

Może być jednak również stosowany w innych chorobach nienowotworowych, w których stosuje się również płynną biopsję. Po odwirowaniu próbki krwi ustalenie, ile osocza lub surowicy należy usunąć, może być trudne, ale przestrzeganie tych konkretnych wskazówek pomoże w tym. Reszta protokołu jest bardzo łatwa do naśladowania przy ograniczonym doświadczeniu w laboratorium.

Procedurę zademonstruje Jorge, technik z naszego laboratorium. Na początek odwiruj probówkę zawierającą świeżą krew w temperaturze pokojowej przez 10 minut w temperaturze 1600 razy g, z zastosowaniem maksymalnej przerwy. Ostrożnie wyjmij probówkę z wirówki.

Górna faza supernatantu surowicy będzie przezroczysta i żółtawa. Sprawdź, czy próbka wykazuje oznaki hemolizy i w razie potrzeby zarejestruj obecność hemolizy. W komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II przenieść surowicę do probówek zbiorczych w postaci podwielokrotności o pojemności 250 mikrolitrów.

Podwielokrotności muszą być prawidłowo oznakowane. Natychmiast zamrozić surowicę w pozycji pionowej w pojemniku do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i zapisać czas przechowywania próbki. Sprawdzić, czy próbki zostały przetworzone w wymaganym czasie czterech godzin.

Odwirować probówkę EDTA w temperaturze pokojowej przez 10 minut w temperaturze 1600 razy g, z zastosowaniem maksymalnej przerwy. Po odwirowaniu supernatant osocza będzie przezroczysty i żółtawy. Sprawdź, czy próbka wykazuje oznaki hemolizy i przenieś osocze do 15-mililitrowej probówki wirówkowej bez naruszania warstwy komórkowej za pomocą jednorazowej pipety serologicznej.

Pozostaw niewielką resztkową objętość osocza nad warstwą komórek na wysokości około pięciu milimetrów. Jeśli zaobserwuje się hemolizę, wyrzuć próbkę do dalszej analizy. Odwirować osocze i 15-mililitrową probówkę wirówkową, aby usunąć wszelkie pozostałości nienaruszonych krwinek przeniesionych z pierwszego etapu wirowania.

Ostrożnie wyjmij probówkę z wirówki, a nie osad komórkowy na dnie probówki, i przenieś od jednego do czterech mililitrów osocza do jednego do czterech mililitrów polipropylenowego biosu kriogenicznego lub Eppendorfów za pomocą jednorazowej pipety serologicznej. Pozostała objętość osocza musi pozostać na dnie probówki, aby uniknąć zanieczyszczenia osocza komórkami krwi. Natychmiast zamrozić osocze w pozycji pionowej w pojemniku do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i zapisać czas przechowywania próbki.

Sprawdź, czy próbki są prawidłowo oznakowane i czy zostały przetworzone w wymaganym czasie czterech godzin. Zbierz warstwę komórkową za pomocą P1000 i przefiltrowanej końcówki i przenieś ją do dwumililitrowej probówki. Natychmiast zamrozić i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Przykład wysokiej jakości ekstrakcji cfDNA, która może być wykorzystana do dalszych zastosowań, jest pokazany tutaj, podczas gdy ten obraz graficzny stanowi przykład nieodpowiedniej próbki o wysokim poziomie zanieczyszczenia genomu. Frakcja osocza lub surowicy musi mieć żółty kolor. Może się to różnić w zależności od konkretnej próbki.

Próbki poddane hemolizie należy wyrzucić. Należy uważać, aby nie usunąć żadnych osadów komórkowych podczas usuwania frakcji osocza. Protokół ten może być również stosowany do innych zastosowań opartych na kwasach nukleinowych i białkach, takich jak wykrywanie niekodujących RNA lub białek w próbkach surowicy i osocza przy użyciu technik wykrywania immunologicznego.

Jest to bardzo standardowa technika stosowana w wielu laboratoriach. Protokół ten pomaga naukowcom ustandaryzować sposób, w jaki przeprowadzamy naszą analizę, ponieważ jest to kluczowy aspekt, niezbędny dla przyszłych zastosowań klinicznych.