Szybkość sedymentacji erytrocytów: charakterystyka oparta na fizyce w kontekście medycznym

Protokół ten dostosowuje pomiary szybkości sedymentacji erytrocytów do najnowszego modelu fizycznego i zapewnia bardziej solidną analizę testu. Protokół ten pozwala na dokładniejsze i bardziej systematyczne wykorzystanie szybkości sedymentacji erytrocytów, ale zapewnia również wartości konwencjonalne. Wcześniej wykazaliśmy, że ta technika jest szczególnie istotna w przypadku zaburzeń charakteryzujących się niską wartością wskaźnika sedymentacji erytrocytów.

Może być stosowany do badań przesiewowych w diagnostyce w kierunku zespołów neuroakantocytozy. Na początek zbierz krew w standardowych 9-mililitrowych probówkach EDTA, a surowicę w standardowych 9-mililitrowych probówkach z surowicą. W celu optymalnego zagęszczenia upakowanych erytrocytów, należy odwirować próbki krwi o masie 3 000 g przez co najmniej siedem minut i odessać supernatant.

Teraz przygotuj mieszaniny autologicznego osocza i surowicy o określonych proporcjach. Na przykład, przygotowując 2,5 mililitra mieszaniny surowicy od 25% do 75% osocza, dodaj 0,625 mililitra osocza do 1,875 mililitra surowicy. Zawiesić osad w PBS lub żądanej cieczy zawieszającej i delikatnie wymieszać po dodaniu supernatantu do przemycia.

Powtórz trzy razy i wykonaj ostatnie pranie żądanym płynem do zawieszania. Wyodrębnić wymaganą objętość upakowanych komórek. Przetwarzaj upakowane komórki jako ciecz o wysokiej lepkości dla 4-mililitrowej próbki o hematokrycie 45% Zawieś 1,8 mililitra upakowanych komórek w 2,2 mililitra mieszanki surowicy osocza lub dowolnej innej pożądanej cieczy.

Aby wyodrębnić wymaganą ilość próbki do oznaczenia hematokrytu, zbuduj naczynia włosowate mikrohematokrytu, zanurzając jego dolną końcówkę w cieczy. Gdy wymagana ilość próbki wzrośnie w probówce z odsysaniem kapilarnym, zakryj otwór, aby zatrzymać przepływ. Następnie uszczelnij naczynia włosowate woskiem uszczelniającym, umieść je w wirówce do mikrohematokrytu i uruchom w stanie 15 000 g przez pięć minut, zgodnie z instrukcjami producenta.

Odczytaj poziom hematokrytu na kapilarze i zapisz go w celach informacyjnych. Teraz, aby zarejestrować sedymentację próbki, ustaw stałą kamerę przed uchwytem, w którym lampy ESR pozostaną w spoczynku, i użyj białego, podświetlanego tła dla lepszego kontrastu. Używając pustych probówek Westergrena bez oznaczeń, ustaw ostrość i pole view kamery, aby uzyskać najwyższą rozdzielczość, w której zostaną umieszczone próbki.

Upewnij się, że obramowania obrazów są wyrównane w kierunku pionowym i poziomym. Następnie zrób zdjęcie wyskalowanej tuby, aby wyodrębnić rozdzielczość pikseli. Ustaw światło i czas ekspozycji aparatu tak, aby miało białe tło, ale bez nasycenia.

Napełnić dolny pojemnik probówki Westergren objętością próbek odpowiadającą instrukcjom producenta i włożyć je do dolnego pojemnika, zgodnie ze wskazaniami producenta. Gdy pierwsza rurka będzie gotowa, umieść ją w uchwycie i rozpocznij nagrywanie z kamery. Rejestrowanie jednego zdjęcia co minutę zwykle daje dobrą rozdzielczość krzywej kinetycznej ESR.

Przygotuj i umieść kolejne próbki. Upewnij się, że nie stoisz przed żadną próbką podczas robienia zdjęcia. Po zarejestrowaniu, aby wyodrębnić krzywą ESR za pomocą kodu MATLAB, wybierz obszar zainteresowania, w którym widoczna jest tylko jedna rurka, część znajdująca się pod najniższą pozycją interfejsu osocza wolnego od komórek erytrocytów, ale w próbce.

Zanotuj wartości X, Y, W i H i użyj tych wartości w skrypcie MATLAB. Przekonwertuj obszar zainteresowania obrazu RGB na obraz lub matrycę w skali szarości. Zazwyczaj połączenie trzech kanałów kolorów jest bardzo wydajne dzięki wyraźnemu tłu.

Następnie zbinaryzuj obraz. W przypadku zdrowej próbki użycie progu ARC2 zwykle daje spójny wynik. W przypadku próbek z wysokim hematokrytem lub pewną hemolizą może być lepsze dostosowanie go ręcznie lub użycie innej metody automatycznej, w zależności od dokładnego kontrastu uzyskanego między różnymi fazami wewnątrz probówki.

Uzyskaj średnią wartości pikseli GR wzdłuż kierunku poziomego. Ten krok minimalizuje szum i skutecznie uśrednia możliwe nieprawidłowości interfejsu. Przed obliczeniem wariacji wygładź krzywą za pomocą średniej ruchomej, zwłaszcza jeśli rury zawierają pewne oznaczenia poziome.

Następnie zidentyfikuj pozycję interfejsu jako punkt o największej zmienności intensywności i powtórz dla każdego obrazu i każdej próbki. Dla każdej próbki należy użyć odpowiedniego oprogramowania, aby zapisać pozycje interfejsu w czasie w odpowiednim formacie, aby pasował do modelu fizycznego. Korzystając z dowolnego, odpowiednio dopasowanego oprogramowania, znając hematokryt i początkową wysokość kolumny krwi, znajdź wartości czasu opóźnienia, czasu bezwymiarowego i końcowej frakcji objętości upakowanych erytrocytów, które minimalizują sumę kwadratów odchyleń resztkowych dla modelu fizycznego.

Po wyodrębnieniu krzywej ilościowej z obrazu zapisz parametry fizyczne próbki. Tradycyjne wartości ESR po 30 minutach, jednej godzinie lub dwóch godzinach można nadal wyodrębnić z krzywej w celach informacyjnych. Prędkość sedymentacji maleje wraz ze wzrostem hematokrytu lub początkowych frakcji objętościowych.

Sedymentacja erytrocytów staje się wolniejsza, gdy stężenie fibrynogenu spada. Przedstawiono zmienność wyekstrahowanej maksymalnej prędkości sedymentacji w funkcji hematokrytu próbki i wartości uzyskanych dla czasu bezwymiarowego, końcowej frakcji objętościowej erytrocytu i czasu opóźnienia. Można zauważyć, że korekta usuwa ogólną zależność od początkowego hematokrytu, a także większość rozproszenia danych.

Przedstawiono charakterystyczne wartości ekstrahowanych parametrów dla różnych stężeń fibrynogenu. Początkowa prędkość sedymentacji na początku procesu sedymentacji wzrasta wraz ze wzrostem stężenia fibrynogenu. Bezwymiarowy czas charakterystyczny sedymentacji zmniejsza się wraz ze wzrostem stężenia fibrynogenu.

Ostateczny udział objętościowy osadzonych erytrocytów jest prawie niezależny od stężenia fibrynogenu. Czas opóźnienia skraca się wraz ze wzrostem stężenia fibrynogenu, co wskazuje, że silniejsze oddziaływania przyciągające przyspieszają przegrupowanie początkowych struktur erytrocytów, co prowadzi do powstania kanałów płynowych. Jednym z krytycznych punktów dotyczących pozyskiwania obrazu jest posiadanie jednolitego jasnego tła, prawda?

Unikaj wyraźnych cieni wokół rurek. Technika ta może być wykorzystana do scharakteryzowania innych chorób związanych z niższym wskaźnikiem sedymentacji erytrocytów, takich jak niedokrwistość sierpowatokrwinkowa lub przewlekła choroba górska.