Obrazowanie poklatkowe 3D dynamiki ściany komórkowej przy użyciu kalkofluoru w physcomitrium patens mchu
10 lutego 2023
Ten manuskrypt przedstawia szczegółowy protokół obrazowania dynamiki 3-wymiarowej ściany komórkowej żywej tkanki mchu, umożliwiając wizualizację odrywania się ścian komórkowych u mutantów ggb i zagęszczania wzorów ścian komórkowych u typu dzikiego podczas rozwoju przez długi okres.
Obrazowanie poklatkowe z mikroskopią fluorescencyjną pozwala na obserwację dynamicznych zmian wzrostu i rozwoju na poziomie komórkowym i subkomórkowym. Ten prosty protokół obrazowania poklatkowego 3D może bezpośrednio badać dynamikę ściany komórkowej przez długi czas. Protokół ten wykorzystuje barwnik kalkofluorowy do oznaczania dynamiki grubości ściany komórkowej, a zatem nie wymaga transformacji białka fluorescencyjnego.
Sygnały kalkofluoru są stabilne i mogą utrzymywać się przez ponad tydzień. Metoda ta może być stosowana do wielu innych systemów o prostych strukturach zawierających ściany komórkowe i może być barwiona kalkofluorem, np. u roślin kwitnących. W tym protokole sygnały kalkofluoru są stabilne, gdy barwnik ten jest mieszany z podłożem podczas całego procesu obrazowania poklatkowego.
Na początek rozprowadź siedmiodniową tkankę mchu w 1,5-mililitrowej mikroprobówce zawierającej 20 mikrolitrów wysterylizowanej wody. W przypadku typu dzikiego użyj kleszczy, aby oddzielić protonemata. W przypadku mutanta ggb należy oddzielić protonematy za pomocą pipety AP-1000.
Dodaj 10 mikrolitrów wysterylizowanego calcofluor-white do mikroprobówki i pozostaw probówkę pionowo w kapturze na dwie minuty w celu zabarwienia. Natychmiast po barwieniu wymieszaj rośliny z 200 mikrolitrami schłodzonego BCDATG zawierającego pożywkę BCDAT, pipetując pięciokrotnie pipetą P1000 i przenieś mieszaninę do naczynia ze szklanej podstawy o średnicy 27 milimetrów. Upewnij się, że 200 mikrolitrów BCDATG z próbkami jest równomiernie rozłożone na powierzchni naczynia ze szklanym dnem o średnicy 27 milimetrów, aby wytworzyć cienką warstwę folii, tak aby próbki znajdowały się w obiektywnej odległości roboczej podczas obrazowania.
Po zestaleniu przez dwie minuty w temperaturze pokojowej przykryj cienką warstwę trzema mililitrami schłodzonego BCDATG i pozostaw na 10 minut do ponownego zestalenia. Na spodzie naczynia narysuj dziewięć linii, każda w kierunku równoległym i prostopadłym, a wiersze zaznacz znakami od A do H, a kolumny cyframi od jednego do ośmiu. Użyj górnego, dolnego, prawego, środkowego i lewego, aby zaznaczyć pozycje w każdym kwadracie.
Na przykład, jeśli roślina znajduje się w kwadracie w drugim rzędzie, w szóstej kolumnie i jest umieszczona w lewej górnej części kwadratu, to roślina ta otrzymuje nazwę b6 w lewym górnym rogu. Umieść naczynie ze szklanym dnem w białym świetle na jeden do dwóch dni, a następnie poddaj je obrazowaniu poklatkowemu codziennie, przez okres do trzech dni. Aby zrekonstruować obrazy 3D, otwórz plik ND2 i kliknij przycisk wolumin.
Zrekonstruuj ścianę komórkową w dniu zero, dniu pierwszym, trzecim i czwartym. Po zrobieniu każdego zdjęcia włóż szklane naczynie z powrotem do komory uprawy. Dynamiczne zmiany w ściankach poprzecznych wykazano za pomocą barwienia kalkofluorem białym w typie dzikim oraz mutantów ggb.
W przypadku mutantów ggb białe przerywane linie poniżej każdego obrazu wskazują uszkodzoną ścianę komórkową powierzchni w rozszerzających się komórkach, a pomarańczowe linie wskazują komórki poniżej powierzchni ściany komórkowej w ggb. Różnice w sygnale kalkofluorowo-białym można wykryć na powierzchni komórek, a mniej zabarwione regiony wskazują na ekspansję komórek w mutantach ggb lub nowo rozgałęzionych miejscach w typie dzikim. W przypadku hodowli wstępnej typu dzikiego, rośliny w słabym czerwonym świetle z góry przez pięć dni są wymagane do wywołania reakcji fototropowych protonematów, tak aby rośliny mogły być przyczepione do dna naczyń, a rośliny mogły pojawić się w obiektywnej odległości roboczej podczas obrazowania, ponieważ kalkofluor-biały może być używany z innym barwnikiem, takim jak mikrosfera.
Można również uzyskać dodatkowe informacje na temat ekspansji komórek. Dynamika ściany komórkowej roślin ma kluczowe znaczenie dla wydajnego wzrostu i rozwoju, a także dla odpowiedzi na sygnały środowiskowe. Protokół ten pozwala na bezpośredni podział zmian w sygnałach ściany komórkowej i integrację.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół obrazowania 3D w trybie time-lapse dynamiki ściany komórkowej w żywej tkance mchu. Metoda ta umożliwia wizualizację odrywania się ściany komórkowej u mutantów ggb oraz wzorców pogrubiania ściany u mchu typu dzikiego podczas rozwoju w wydłużonym okresie czasu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Rozwój roślin
- Techniki mikroskopowe
Wprowadzenie
- Obrazowanie poklatkowe jest kluczowe dla obserwacji dynamiki komórkowej.
- Mikroskopia fluorescencyjna umożliwia szczegółową wizualizację procesów wzrostu.
- Barwnik Calcofluor jest stosowany do barwienia ścian komórkowych bez konieczności transformacji białkami fluorescencyjnymi.
- Stabilność sygnałów Calcofluor zwiększa wiarygodność obrazowania w czasie.
Cel badania
- Opracowanie protokołu do obserwacji dynamiki ściany komórkowej u mchu.
- Zbadanie różnic w zachowaniu ściany komórkowej pomiędzy mutantami ggb a mchem typu dzikiego.
- Przedstawienie metody możliwej do zastosowania w innych systemach roślinnych posiadających ściany komórkowe.
Zastosowane metody
- Obrazowanie 3D w trybie time-lapse z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej.
- Zastosowanie barwnika calcofluor do znakowania dynamiki ściany komórkowej.
- Utrzymanie stabilnych sygnałów calcofluoru przez cały proces obrazowania.
- Zastosowanie protokołu w różnych systemach roślinnych.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja odrywania się ściany komórkowej u mutantów ggb.
- Obserwacja wzorców pogrubiania u mchu typu dzikiego.
- Wykazanie możliwości zastosowania protokołu w odniesieniu do innych struktur roślinnych.
- Potwierdzenie stabilnych sygnałów calcofluor podczas wydłużonych okresów obrazowania.
Wnioski
- Protokół ten zapewnia niezawodną metodę badania dynamiki ściany komórkowej.
- Uzyskane informacje mogą poszerzyć wiedzę na temat rozwoju roślin.
- Metodę tę można dostosować do zastosowania u różnych gatunków roślin.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Trójwymiarowe obrazowanie time-lapse dynamiki ściany komórkowej z wykorzystaniem calcofluoru u Physcomitrium patens umożliwia bezpośrednią, ilościową wizualizację przebudowy ściany komórkowej w dłuższych okresach czasu bez konieczności transformacji genetycznej. Podejście to sprzyja redukcji ryzyka mechanistycznego i zwiększa pewność prognostyczną w biologii ścian komórkowych roślin, co jest kluczowe dla wczesnego odkrywania i walidacji celów w inżynierii cech upraw oraz bioprodukcji roślinnej. Stabilność i adaptacyjność tej metody sprawiają, że stanowi ona wielokrotnego użytku narzędzie dla różnorodnych systemów posiadających ściany komórkowe.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę mechanizmów przebudowy i rozszerzania ściany komórkowej w żywych tkankach.
- Wspiera walidację funkcjonalną perturbacji genetycznych wpływających na integralność ściany komórkowej.
- Zwiększa pewność predykcji w przypisywaniu szlaków i priorytetyzacji celów w biosyntezie ścian komórkowych roślin.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowany, powtarzalny odczyt dynamiki ściany komórkowej bez konieczności stosowania linii transgenicznych.
- Dostarcza ilościowe wyniki obrazowania w rozdzielczości czasowej, odpowiednie do analizy porównawczej między genotypami lub wariantami traktowania.
- Umożliwia skalowalne przygotowanie zwalidowanych układów biologicznych do dalszych etapów procesów przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wspiera rozwój biomarkerów translacyjnych poprzez korelację wzorców barwienia ściany komórkowej z przyszłymi miejscami ekspansji lub rozgałęzień.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną w systemach produkcji opartych na roślinach.
- Zmniejsza ryzyko biologiczne, dostarczając wglądu w mechanizmy powstawania defektów ściany komórkowej i ich konsekwencje fenotypowe.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół obrazowania wpisuje się w kontinuum od etapu odkryć po badania przedkliniczne w obszarze badań nad ścianą komórkową roślin, wspierając zarówno studia oparte na hipotezach, jak i kampanie przesiewowe.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących ekspansji i integralności ściany komórkowej w żywych tkankach.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki obrazowania do rozwoju testów i oceny związków.
- Analityka: Wspiera statystyczne porównanie dynamiki ściany komórkowej w różnych genotypach i punktach czasowych.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie biomarkerów obrazowania do wyników fenotypowych istotnych dla produktywności roślin.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Możliwość adaptacji do wielu systemów roślinnych i kontekstów eksperymentalnych wymagających wizualizacji ściany komórkowej.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w biologii ściany komórkowej.
- Wartość operacyjna: Oferuje zestandaryzowane, skalowalne i powtarzalne przepływy pracy w obrazowaniu bez konieczności modyfikacji genetycznych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go i zwiększa efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnej redukcji ryzyka w odniesieniu do celów związanych ze ścianą komórkową.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów B+R opartych na roślinach.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w zakresie mikroskopii fluorescencyjnej oraz analizy obrazowania time-lapse.
- Niezbędny jest dostęp do stabilnego barwnika calcofluor oraz kompatybilnej aparatury obrazującej.
- Wymagana jest międzyzespołowa standaryzacja protokołów przygotowania próbek i obrazowania.
- Metoda jest dostosowywalna do różnych systemów roślinnych z ścianami komórkowymi podatnymi na barwienie calcofluorem.
- Stabilność sygnału i czas trwania obrazowania powinny zostać zwalidowane dla każdego nowego systemu.
