Mikroskopia sił atomowych w trybie kontaktowym jako szybka technika obserwacji morfologicznej i analizy uszkodzeń komórek bakteryjnych
30 czerwca 2023
Tutaj prezentujemy zastosowanie mikroskopii sił atomowych (AFM) jako prostej i szybkiej metody charakteryzacji bakterii i analizujemy szczegóły, takie jak rozmiar i kształt bakterii, biofilmy kultur bakteryjnych oraz aktywność nanocząsteczek jako środków bakteriobójczych.
Protokół ten pokazuje zastosowanie mikroskopii sił atomowych w trybie kontaktowym do obserwacji zmian w morfologii komórek spowodowanych określoną chorobą lub leczeniem. Zdecydowanie zaleca się używanie szczelnych pojemników do tej procedury, aby uniknąć zanieczyszczenia i jak najszybszą analizę utrwalonej próbki, aby uniknąć starzenia. Rozpocząć od zamocowania próbek na szkiełku, delikatnie przesuwając szkiełko kilka razy nad płomieniem, aż próbka wyschnie.
Umieścić utrwalone próbki na szalce Petriego i przetransportować je do mikroskopu sił atomowych w celu obserwacji. Następnie włącz komputer i mikroskop sił atomowych. Następnie wybierz tryb kontaktu, sondy ContAI-G i opcje automatycznego nachylenia w oprogramowaniu.
Ustaw domyślne wartości dla kontrolera Z, ustawiając nastawę na 20 nanometrów, wzmocnienie P na 10 000, wzmocnienie I na 1 000, wzmocnienie D na zero i napięcie końcówki na zero miliwoltów. Korzystając z głowicy o zakresie skanowania 70 mikrometrów, umieść próbki w trybie kontaktowym AFM. Uzyskaj szybki podgląd powierzchni obszaru pod sondą za pomocą kamery zamontowanej na dwóch soczewkach zintegrowanych z głowicą skanującą.
Teraz wybierz żądany obszar, ręcznie przesuwając go w płaszczyźnie XY. Pozwól sondzie elektronicznie zbliżyć się do powierzchni próbki, aż do osiągnięcia kontaktu. Elektronicznie dostosuj płaszczyznę pomiarową XY skanera i powierzchnię próbki, zmniejszając kierunek nachylenia XY.
Ustaw standardowe parametry oprogramowania na jedną linię na sekundę i 256 punktów na linię. Następnie wykonaj pełny zakres skanowania obszaru o wymiarach 70 na 70 mikrometrów. Zaznacz mniejszy obszar za pomocą narzędzia do powiększania.
Wybierz nowy obszar z próbki, cofając elektronicznie wspornik i przesuwając próbkę wzdłuż płaszczyzny XY. Następnie wykonaj nowe skanowanie, jak pokazano wcześniej. Następnie użyj wyrównywania linia po linii w menu narzędzi obrazu w wyborze filtrów, aby przeprowadzić przetwarzanie danych.
Zoptymalizuj maksymalną i minimalną wysokość paska kolorów, aby uzyskać najlepszą rozdzielczość obrazu. Na koniec przeprowadź analizę obrazu za pomocą menu analizy. Wybierz punkt początkowy i końcowy za pomocą żądanego narzędzia, aby określić długość i odległość.
Mikroskopowa analiza sił atomowych kultur bakteryjnych wykazała, że kultury Staphylococcus aureus były rozmieszczone w strefach z agregatami ziarniaków. Zwiększone skale wykazały, że w większym stopniu doceniano rozmieszczenie populacji i morfologię ziarniaków. Obrazy w trybie kontaktowym AFM pozwoliły na określenie wielkości ziarniaków, które wykazywały średnią szerokość 1,25 mikrometra.
Pseudomonas hunanensis wykazywał jednorodne rozmieszczenie na całej powierzchni nośnej szkła, tworząc przylegającą monowarstwę. Kultury miały kształt pałeczek o długości 1,9 mikrometra i szerokości 0,9 mikrometra. Mikrorozcieńczenie nanocząstek tlenku magnezu Staphylococcus aureus spowodowało utratę gładkiej powierzchni i jednorodnych konturów z powodu poważnego pogorszenia struktury komórkowej.
Tworzenie pęcherzyków i uwalnianie materiału cytozolowego obserwowano w hodowlach w stężeniach wyższych niż MIC. Podobne wyniki uzyskano w hodowlach E. coli, gdzie kontrole wykazywały gładkie powierzchnie, co podkreślało jej jednorodny kształt przypominający pręciki. Struktura całkowicie zniknęła przy ekspozycji na nanocząstki 1000 PPM, a widoczne były tylko ich sylwetki.
Ważne jest, aby prawidłowo wykonać mocowanie próbki, ponieważ jest to niezbędne do dalszej analizy. Filtr obrazu pomaga zapewnić dobrą rozdzielczość obrazu i szczegóły próbki. Korzystając z metody mocowania, można zastosować tryby bezdotykowe AFM, które mogą być pomocne w badaniu właściwości mechanicznych.
Metodologia ta może być niedrogim i użytecznym narzędziem do badań medycznych i mikrobiologicznych skoncentrowanych na analizie uszkodzeń komórek bakteryjnych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym badaniu wykorzystano mikroskopię sił atomowych (AFM) do szczegółowej charakterystyki bakterii, koncentrując się na ich wielkości, kształcie, biofilmach hodowlanych oraz działaniu bakteriobójczym nanocząsteczek. Protokół kładzie nacisk na staranne przygotowanie próbek oraz zastosowanie specyficznych technik obrazowania w celu obserwacji zmian morfologicznych w komórkach bakteryjnych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Mikrobiologia
- Charakterystyka bakterii
- Badania nad nanocząsteczkami
Wstęp
- Mikroskopia sił atomowych jest ważnym narzędziem do obserwacji morfologii bakterii.
- Zrozumienie procesu tworzenia się biofilmu bakteryjnego oraz odpowiedzi na środki bakteriobójcze wspomaga badania medyczne.
- Przygotowanie próbki jest kluczowe dla dokładnego obrazowania i analizy.
Zastosowane metody
- Mikroskopia sił atomowych w trybie kontaktowym
- Kultury Staphylococcus aureus i Pseudomonas hunanensis
- Testy ekspozycji na nanocząstki
Główne wyniki
- Analiza AFM ujawniła rozmiar i rozkład komórek bakteryjnych, przy czym Staphylococcus aureus wykazywał średnią szerokość 1,25 micrometers.
- Zwiększone stężenia nanocząsteczek tlenku magnezu doprowadziły do znaczących zmian morfologicznych w komórkach bakteryjnych.
- Badanie wykazuje skuteczność AFM w analizie integralności strukturalnej bakterii.
Wnioski
- Niniejsza metodologia podkreśla użyteczność AFM w mikrobiologii, w szczególności w ocenie uszkodzeń bakterii.
- Wyniki przyczyniają się do szerszego zrozumienia reakcji bakterii na stosowane terapie.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Skaningowa mikroskopia sił atomowych (AFM) w trybie kontaktowym umożliwia szybką, wysokorozdzielczą ocenę morfologiczną komórek bakteryjnych, wspierając wczesną ewaluację interwencji przeciwdrobnoustrojowych. Technika ta dostarcza praktycznych danych dotyczących topografii 3D oraz uszkodzeń komórek bez złożoności i kosztów związanych z mikroskopią elektronową, co ułatwia efektywny screening wpływu nanocząsteczek na integralność bakterii. Prostota operacyjna i ilościowe wyniki AFM czynią z tej metody cenne narzędzie do redukcji ryzyka mechanistycznego oraz walidacji celów w procesach odkrywania nowych środków przeciwinfekcyjnych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację morfologii komórek bakteryjnych oraz zmian strukturalnych po ekspozycji na związek.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez ilościowe określanie uszkodzeń komórek i zaburzeń morfologicznych w skali nanometrycznej.
- Ułatwia szybką weryfikację hipotez dotyczących mechanizmów działania środków przeciwmikrobowych.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Zapewnia powtarzalne, ilościowe dane topograficzne do standaryzacji i walidacji testów.
- Przyspiesza przesiewowe badanie bibliotek nanocząsteczek lub związków pod kątem działania bakteriobójczego.
- Dostarcza wysokotrybną analizę obrazową (high-content imaging), odpowiednią do dalszej analityki porównawczej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje odczyty morfologiczne z translacyjnymi biomarkerami integralności komórek bakteryjnych.
- Zapewnia ciągłość procesu od odkryć in vitro po walidację przedkliniczną kandydatów na leki przeciwdrobnoustrojowe.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektów w oparciu o ocenę ryzyka, dostarczając solidnych dowodów na wpływ komórkowy.
Integracja potoku i przepływu pracy
Tryb kontaktowy AFM wpisuje się w kontinuum od odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając wczesną, ilościową ocenę uszkodzeń i morfologii komórek bakteryjnych w odpowiedzi na testowane interwencje.
- Biologia odkrywcza: Wspiera ocenę mechanizmów przeciwdrobnoustrojowych i celów komórkowych w oparciu o postawione hipotezy.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowanych, powtarzalnych danych obrazowych do selekcji i priorytetyzacji związków.
- Analityka: Zapewnia ilościowe pomiary wielkości komórek, integralności powierzchni oraz zaburzeń morfologicznych.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki in vitro z modelami przedklinicznymi poprzez ujednolicenie punktów końcowych morfologii.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Oferuje skalowalną, kosztowo efektywną platformę do wielokrotnego zastosowania w różnych szczepach bakteryjnych i klasach związków.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w badaniach nad skutecznością przeciwdrobnoustrojową i mechanizmem działania.
- Wartość operacyjna: Redukuje czas i koszty w porównaniu z mikroskopią elektronową, zachowując jednocześnie wysoką rozdzielczość wyników.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczenie solidnych, ilościowych dowodów na wpływ komórkowy.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów na leki przeciwdrobnoustrojowe z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o bezpośrednie dowody morfologiczne.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu obsługi AFM oraz przygotowania próbek w celu zapewnienia wysokiej jakości danych.
- Konieczny jest dostęp do aparatury AFM z możliwością pracy w trybie kontaktowym oraz odpowiednimi sondami.
- Wymagane są zestandaryzowane protokoły utrwalania próbek i obrazowania, aby zapewnić powtarzalność wyników między zespołami.
- Metoda jest możliwa do adaptacji dla różnych szczepów bakteryjnych i rodzajów nanocząsteczek po optymalizacji protokołu.
- Należy zminimalizować starzenie się i zanieczyszczenie próbek, aby zachować integralność morfologiczną niezbędną do analizy.
