Wykorzystanie platformy tkankowej bariery mikroSiM (μSiM) do modelowania bariery krew-mózg

Opracowujemy model chipa tkankowego bariery krew-mózg, aby zrozumieć wpływ sepsy na mózg i udział czynników przenoszonych przez krew. Korzystając z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, planujemy ocenić wpływ czynników genetycznych na podatność niektórych populacji pacjentów. Obecnymi wyzwaniami eksperymentalnymi w społeczności zajmującej się chipami tkankowymi są odtwarzalność wyników i przyjęcie technik przez laboratoria zewnętrzne.

Unikalne projekty chipów tkankowych, małe objętości w chipie tkankowym i brak standardowych testów funkcjonalnych przyczyniają się do tych wyzwań i często ograniczają użytkowników do testów opartych na fluorescencji jako ich głównym wyniku. Urządzenia microSIM oferują modułowość do wszechstronnego modelowania in vitro, powierzchnię przypominającą szkło, idealną do obrazowania w wysokiej rozdzielczości oraz ultracienką, wysoce porowatą nanomembranę o długości 100 nanometrów, zapewniając bezproblemowy przesłuch czynników rozpuszczalnych i precyzyjne testy przepuszczalności. W przypadku microSIM zaobserwowaliśmy, że określone typy komórek mają tendencję do wytwarzania większej ilości białek macierzy, które zapewniają rusztowanie podtrzymujące wokół naczyń krwionośnych mózgu.

Teraz możemy zapytać, czy stan zapalny powoduje, że te same komórki wzmacniają lub rozkładają swoje matryce, zmieniając w ten sposób integralność bariery. W przyszłości dodamy kolejny przedział do modelu z zielonymi komórkami, takimi jak astrocyty i mikroglej, aby zbadać, w jaki sposób te komórki oddziałują z barierą krew-mózg w przypadkach ogólnoustrojowego stanu zapalnego, takiego jak sepsa. Planujemy również zbadać dodatkowe przyczyny ogólnoustrojowego stanu zapalnego, takie jak majaczenie pooperacyjne nakładające się na demencję.

Aby rozpocząć, umieść wszystkie materiały potrzebne do montażu urządzenia microSIM w kapturze bezpieczeństwa biologicznego. Za pomocą pęsety do wiórów umieść chip membranowy na środku uchwytu A1. Płaska powierzchnia wióra jest skierowana w dół, a obszar wykopu jest skierowany do góry. Przechyl urządzenie za pomocą wióra, aby pokazać odbicie od wykopu.

Odklej niebieskie warstwy ochronne po obu stronach komponentu pierwszego za pomocą prostej pęsety i umieść go w uchwycie A1 z górną komorą skierowaną w dół. Następnie delikatnie dociśnij komponent pierwszy, aż PSA dotknie chipa. Umieść uchwyt A2 na uchwycie A1 i mocno dociśnij w różnych rogach, aby zapewnić ścisłe dopasowanie chipa i komponentu.

Aby przykleić element drugi do elementu pierwszego za pomocą wióra, chwyć jeden róg elementu drugiego prostą pęsetą i oderwij go od arkusza. Następnie chwyć obszar nie-PSA lub trójkąt składnika drugiego i usuń niebieskie warstwy składnika drugiego, odsłaniając powierzchnię PSA. Umieść komponent drugi w uchwycie B1 stroną PSA do góry.

Następnie umieść komponent pierwszy wraz z chipem membranowym w uchwycie B1 z górną komorą skierowaną do góry. Umieść uchwyt B2 na elemencie pierwszym i mocno dociśnij w różnych rogach. Wyjmij zmontowane urządzenie z oprawy i za pomocą prostej pęsety uszczelnij krawędzie kanału.

Przed użyciem urządzenia do hodowli komórek sterylizuj je światłem ultrafioletowym przez 20 minut. Aby rozpocząć, umieść zmontowane urządzenie microSIM w sterylnych zaciskach węża. Hoduj urządzenie na dużej sterylnej szalce Petriego.

Aby uzyskać dodatkową wilgotność, umieść stożkową pokrywę rurki o pojemności 50 mililitrów wypełnioną sterylną wodą. Aby przygotować urządzenie do hodowli komórek, przepłucz górną komorę 100 mikrolitrami wody. Następnie przygotuj roztwór powlekający, mieszając kolagen cztery, fibronektynę bydlęcą i sterylną wodę.

Usuń wodę z górnej komory i dodaj 100 mikrolitrów roztworu powlekającego. Inkubuj komorę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do czterech godzin. Po inkubacji zastąpić roztwór powlekający w górnej komorze 100 mikrolitrami hECSR o temperaturze pokojowej.

Dodać 20 mikrolitrów roztworu hECSR do dolnej komory. Aby przejść przez komórki podobne do EECM-BMEC, dodaj do komórek mieszaninę enzymów odłączających komórki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do ośmiu minut. Następnie odpipetować zawiesinę komórek i dodać ją do czterokrotnej objętości śródbłonka w probówce wirówkowej.

Wirować przy 200 G przez pięć minut i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze hECSR. Zasiej komórki o gęstości 40 000 komórek na centymetr kwadratowy w górnej komorze i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do czterech godzin, aby ułatwić adhezję komórek. Po inkubacji wymienić pożywkę na świeży hECSR w obu komorach.

Napraw komórki, dodając 20 mikrolitrów 100% metanolu, schłodzonego w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, do dolnej komory i 50 mikrolitrów do górnej komory. Inkubuj urządzenie w temperaturze pokojowej przez dwie do 10 minut. Następnie umyj komórki, dodając 20 mikrolitrów PBS do dolnej komory i 100 mikrolitrów do górnej komory.

Po każdym praniu potwierdź brak pęcherzyków w dolnej komorze. Zablokuj komórki na 30 minut, dodając 20 mikrolitrów roztworu blokującego do dolnej komory i 50 mikrolitrów do górnej komory. Po zablokowaniu zastąpić objętość w górnej komorze 50 mikrolitrami roztworu przeciwciała pierwotnego i inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej.

Po przemyciu PBS dodać 50 mikrolitrów roztworu przeciwciał wtórnych do górnej komory i inkubować przez godzinę, chroniąc przed światłem. Po umyciu PBS dodać 50 mikrolitrów Hoechst do górnej komory i inkubować przez trzy minuty. Następnie dodaj 20 mikrolitrów PBS do dolnej komory i 100 mikrolitrów do górnej komory.

Natychmiast zobrazuj urządzenie pod mikroskopem konfokalnym. Zlokalizuj okienko membrany za pomocą mokrego obiektywu o dużej odległości roboczej 40x i przełącz się na kanały fluorescencyjne, aby sprawdzić barwienie Hoechst i złącza. Wykazano tutaj optymalne gęstości wysiewu dla hodowli komórek hiPSC i niedosiewu BPLC.

Kokultura pochodząca z hiPSC była łatwiejsza do odróżnienia w obrazowaniu z kontrastem fazowym niż w pierwotnych kokulturach. Niskie wysiewanie BPLC powoduje słabe pokrycie perycytów i zbrylanie, podczas gdy nadmierne wysiewanie prowadzi do złuszczania się warstwy perycytów z błony. W immunologicznie wybarwionej kokulturze komórkowej pochodzącej z hiPSC zaobserwowano dwie warstwy komórek znajdujące się w bliskim sąsiedztwie, oddzielone jedynie cienką nanomembraną z azotku krzemu.

W teście przepuszczalności duża zmienność przepuszczalności komórek śródbłonka hodowanych przez dwa dni wskazuje, że dwa dni hodowli były niewystarczające do dojrzewania bariery. Co więcej, nie było znaczących różnic w przepuszczalności między laboratoriami po dojrzewaniu barierowym od czterech dni.