Identyfikacja peptydów małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego
30 czerwca 2023
Ten protokół opisuje procedurę izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od makrofagów za pomocą różnicowego ultrawirowania i ekstrakcji peptydomu do identyfikacji za pomocą spektrometrii mas.
Badamy funkcjonalne role pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w odporności wrodzonej. Opracowaliśmy protokół izolacji małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (sEVs) poprzez ultrawirowanie różnicowe i identyfikację peptydome za pomocą LC-MS / MS, ujawniając kluczowe funkcje biologiczne peptydów w sEV. Wykazano, że pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pośredniczą w komunikacji międzykomórkowej poprzez transport ładunku do komórek biorcy, takiego jak białka, lipidy i kwasy nukleinowe.
Uwalniając składniki przeciwdrobnoustrojowe, działają jako pierwsza linia obrony przed inwazyjnymi drobnoustrojami w odporności wrodzonej. Podczas gdy ultrawirowanie różnicowe daje bardzo czyste małe zewnątrzkomórkowe sEV, może być czasochłonne i często skutkuje niskimi plonami. W naszym badaniu są to główne wyzwania dla stabilnej identyfikacji peptydów o niskiej liczebności w sEV.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół izolacji małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (sEVs) z makrofagów przy użyciu różnicowego ultrawirowania. Następnie ekstrahowano i identyfikowano za pomocą spektrometrii mas peptidom tych pęcherzyków, co pozwoliło na podkreślenie ich roli w odporności wrodzonej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Immunologia
- Biologia komórki
Wprowadzenie
- Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są kluczowe dla komunikacji międzykomórkowej.
- Transportują one różne biomolekuły, w tym białka i kwasy nukleinowe.
- sEV odgrywają istotną rolę w odporności wrodzonej poprzez uwalnianie komponentów przeciwdrobnoustrojowych.
- Izolacja sEV może być trudna ze względu na niską wydajność i czasochłonność procesów.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnego protokołu izolacji sEV z makrofagów.
- Identyfikacja peptydomu sEV oraz zrozumienie ich funkcji biologicznych.
- Rozwiązanie problemów związanych z identyfikacją peptydów o niskiej zawartości w sEV.
Zastosowane metody
- Różnicowe wirowanie w ultrecentryfudze w celu izolacji sEV.
- Spektrometria mas (LC-MS/MS) do identyfikacji peptidomu.
- Analiza funkcji peptydów w sEV.
- Ocena czystości i wydajności izolowanych sEV.
Główne wyniki
- Pomyślnie wyizolowano wysoko oczyszczone sEV z makrofagów.
- Zidentyfikowano kluczowe peptydy zaangażowane w odpowiedzi odporności wrodzonej.
- Wykazano rolę sEV w pośredniczeniu w komunikacji międzykomórkowej.
- Zwrócono uwagę na trudności w uzyskaniu stabilnej identyfikacji peptydów o niskiej liczności.
Wnioski
- Opracowany protokół usprawnia izolację sEV w celu przeprowadzenia dalszych badań.
- Identyfikacja peptidomu pozwala na uzyskanie informacji o funkcjach biologicznych sEV.
- Przyszłe badania mogą skoncentrować się na zwiększeniu wydajności oraz stabilności identyfikacji peptydów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Systematyczna identyfikacja peptydomu w małych pęcherzykach zewnątrzkomórkowych (sEVs) pochodzących z makrofagów szpiku kostnego pozwala na głębsze zrozumienie mechanizmów sygnalizacji odporności wrodzonej oraz komunikacji międzykomórkowej. Niniejszy schemat postępowania rozwiązuje istotny problem na etapie odkryć: izolację i charakterystykę niskonapięciowych bioaktywnych peptydów, które mogą pełnić funkcję efektorów funkcjonalnych lub biomarkerów. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów i dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o portfelu projektów z uwzględnieniem ryzyka w obszarze immunologii i terapii komórkowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie szlaków odporności wrodzonej pośredniczonych przez peptydy pochodzące z sEV.
- Wspiera biologiczną minimalizację ryzyka poprzez wyjaśnienie funkcji ładunku peptydowego w sygnalizacji makrofagów.
- Ułatwia uzyskanie pewności prognostycznej przy wyborze celów immunomodulacyjnych do dalszych badań.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Zapewnia zwalidowany schemat postępowania w celu izolacji wysokiej czystości sEV odpowiednich do późniejszej analizy peptydomicznej.
- Ustanawia powtarzalną kwantyfikację endogennych peptydów w oparciu o LC-MS/MS.
- Umożliwia standaryzację identyfikacji peptydów na potrzeby badań przesiewowych i studiów porównawczych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie analizy ładunku peptydowego do modeli immunologicznych istotnych dla danej choroby.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia po przedkliniczną walidację mechanizmów immunomodulujących.
- Wspiera strategie translacyjne w zakresie biomarkerów poprzez charakterystykę peptydów związanych z pęcherzykami.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając dokładne profilowanie peptidomu sEV, co wspiera zarówno badania mechanistyczne, jak i badania translacyjne w dziedzinie immunologii.
- Biologia odkrywcza: Rozszerza testowanie hipotez dotyczących funkcjonalnych ról peptydów sEV w odporności wrodzonej.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych profili peptydowych do analizy porównawczej.
- Analityka: Wykorzystuje LC-MS/MS do generowania wiarygodnych identyfikacji peptydów oraz pomiarów ich zawartości.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki odkryć z przedklinicznymi modelami odporności poprzez charakterystykę ładunku pęcherzyków.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do analizy peptydomu sEV w różnych typach komórek odpornościowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów immunologicznych i ograniczaniu ryzyka mechanistycznego.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje izolację sEV oraz analizę peptydomu w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji go/no-go poprzez wyjaśnienie mechanizmów immunologicznych zależnych od peptydów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację programów immunomodulacyjnych w oparciu o analizę ryzyka.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie różnicowej ultracentryfugacji oraz analiz LC-MS/MS.
- Wymaga dostępu do szybkich wirówek oraz zaawansowanej infrastruktury spektrometrii mas.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalnej identyfikacji peptydów.
- Może wymagać adaptacji dla różnych źródeł komórek lub podtypów pęcherzyków.
- Niska wydajność i czasochłonna izolacja pozostają praktycznymi ograniczeniami w zastosowaniach wysokoprzepustowych.
