Czuła na polaryzację mikroskopia dwufotonowa do bezznacznikowej charakterystyki strukturalnej amyloidu
8 września 2023
Ten artykuł opisuje, jak można zastosować mikroskopię dwufotonową wrażliwą na polaryzację, aby scharakteryzować lokalną organizację w obrębie bezznacznikowych nadbudówek amyloidowych-sferulitów. Opisano w nim również, jak przygotować i zmierzyć próbkę, skompletować wymaganą konfigurację i przeanalizować dane w celu uzyskania informacji o lokalnej organizacji włókienek amyloidowych.
Naszym celem jest opracowanie nowych markerów optycznych i technik detekcji agregatów białkowych zwanych amyloidami. Są one zaangażowane w szereg chorób, takich jak choroba Alzheimera i cukrzyca typu drugiego. Tak więc, aby wyleczyć te choroby, musimy dysponować technikami wizualizacji amyloidów.
Wykazaliśmy, że mikroskopia dwufotonowa może być wykorzystana do wykrycia orientacji włókienek amyloidowych wewnątrz nadbudówek amyloidowych. Można to osiągnąć nie tylko za pomocą barwników specyficznych dla amyloidu, ale także poprzez wykorzystanie autofluorescencji amyloidów. Ponieważ nasza technika działa na nieliniowe zjawiska optyczne, może osiągnąć zmniejszoną fotoselekcję kątową, zwiększyć rozdzielczość osiową, mniejsze rozpraszanie światła, niższą fototoksyczność i głębszą penetrację próbki w porównaniu z techniką mikroskopii fluorescencji jednofotonowej.
Wrażliwa na polaryzację dwufotonowa mikroskopia fluorescencyjna jest obiecującym narzędziem do obrazowania wewnętrznej struktury różnych złożonych struktur biologicznych, nie tylko agregatów białkowych, ale także pęcherzyków DNA i błon lipidowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje zastosowanie mikroskopii dwufotonowej czułej na polaryzację do charakteryzacji lokalnej organizacji bezznacznikowych superstruktur amyloidowych, znanych jako sferulity. Praca ta kładzie nacisk na procesy przygotowania, pomiaru i analizy danych niezbędne do badania włókien amyloidowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biofizyka
- Techniki mikroskopowe
Wstęp
- Amyloidy to agregaty białkowe powiązane z chorobami, takimi jak choroba Alzheimera i cukrzyca typu 2.
- Techniki wizualizacji są niezbędne do zrozumienia struktur amyloidowych.
- Mikroskopia dwufotonowa oferuje przewagi nad metodami tradycyjnymi.
- Nieliniowe zjawiska optyczne zwiększają możliwości obrazowania.
Cel badania
- Opracowanie markerów optycznych do wykrywania amyloidów.
- Wizualizacja orientacji włókien amyloidowych w obrębie superstruktur.
- Udoskonalenie technik obrazowania w celu lepszego zrozumienia przebiegu chorób.
Zastosowane metody
- Mikroskopia dwufotonowa wrażliwa na polaryzację.
- Wykorzystanie barwników specyficznych dla amyloidu oraz autofluorescencji.
- Protokoły przygotowania próbek i pomiarów.
- Analiza danych w celu charakterystyki lokalnej organizacji.
Główne wyniki
- Wykazano skuteczną detekcję orientacji włókien amyloidowych.
- Zaobserwowano zmniejszoną fotoselekcję kątową i zwiększoną rozdzielczość osiową.
- Zredukowano rozpraszanie światła i fototoksyczność w porównaniu z technikami jednofotonowymi.
- Osiągnięto głębszą penetrację próbki, co pozwoliło na lepsze obrazowanie.
Wnioski
- Mikroskopia dwufotonowa czuła na polaryzację jest obiecującym narzędziem w badaniach nad amyloidami.
- Technika ta może znacząco poprawić wizualizację struktur amyloidalnych.
- Przyszłe zastosowania mogą pogłębić zrozumienie chorób związanych z amyloidami.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Mikroskopia dwufotonowa wrażliwa na polaryzację (ps-2PFM) umożliwia bezetykietową, wysokorozdzielczą charakterystykę strukturalną agregatów amyloidowych, co stanowi krytyczne wyzwanie w badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi. Dzięki rozdzielczeniu trójwymiarowej organizacji włókien w obrębie sferulitów, metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w procesach wczesnego wykrywania i walidacji celów terapeutycznych. Zdolność tej techniki do badania uporządkowania molekularnego w złożonych systemach biologicznych wspiera podejmowanie decyzji portfelowych z uwzględnieniem ryzyka w obszarze badań i rozwoju (R&D) w branży biofarmaceutycznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację orientacji włókien amyloidowych i uporządkowania molekularnego bez użycia egzogennych znaczników.
- Wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka poprzez wyjaśnienie dróg agregacji białek istotnych dla etiologii chorób.
- Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych w chorobach neurodegeneracyjnych i zaburzeniach wynikających z błędnego sfałdowania białek.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Ułatwia przygotowanie zwalidowanych, wolnych od znaczników systemów biologicznych do późniejszych etapów procesów przesiewowych.
- Zapewnia ilościowe i powtarzalne odczyty organizacji fibryli w celu standaryzacji testu.
- Umożliwia wiarygodną ocenę wpływu związków na strukturę amyloidu w modelach przedklinicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie charakterystyki strukturalnej amyloidów z opracowywaniem istotnych w kontekście chorób biomarkerów.
- Wspiera ciągłość translacyjną, od etapu odkrywania po przedkliniczną walidację terapeutyków modulujących agregację.
- Dostarcza wglądu w mechanizmy, który pozwala na podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka.
Integracja potoku i przepływu pracy
ps-2PFM integruje się z continuum od odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając opartą na hipotezach analizę agregacji białek, co wspiera zarówno wczesne etapy odkrywania, jak i badania translacyjne.
- Biologia odkrywcza: Usprawnia weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków dla celów amyloidogennych.
- Przesiewanie: Zapewnia ilościowe, powtarzalne pomiary orientacji fibryli w celu przygotowania testu.
- Analityka: Generuje odczyty strukturalne umożliwiające analizę porównawczą w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy charakterystykę molekularną ze strategiami biomarkerów istotnymi dla przebiegu choroby.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Oferuje możliwość ponownego wykorzystania bezetykietowego obrazowania w różnorodnych badaniach nad agregacją białek.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad amyloidami.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność procesów obrazowania strukturalnego.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz zwiększa efektywność kapitałową dzięki wcześniejszemu wyjaśnieniu mechanizmów agregacji.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację programów terapeutycznych ukierunkowanych na agregację z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu nielinearnej mikroskopii optycznej oraz analizy polaryzacyjnej.
- Konieczne jest zastosowanie zaawansowanej aparatury do wzbudzania dwufotonowego i detekcji czułej na polaryzację.
- Wymagana jest standaryzacja protokołów obrazowania i potoków analizy danych pomiędzy zespołami.
- Możlizna może być konieczność adaptacji metody dla różnych agregatów białkowych lub systemów tkankowych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują złożoność przygotowania próbek oraz dostępność aparatury.
