Rozdzielona siatkówka jako ulepszone przygotowanie płaskie do badania neuronów wewnętrznej warstwy jądrowej w siatkówce kręgowej
16 stycznia 2024
Praca ta przedstawia alternatywne przygotowanie siatkówki płaskie, w którym usunięcie ciał komórek fotoreceptorowych umożliwia szybszą dyfuzję przeciwciał oraz poprawiony dostęp pipety plastrowej do wewnętrznych neuronów siatkówki do immunohistochemii, hybrydyzacji in situ oraz eksperymentów elektrofizjologicznych.
Nasza grupa interesuje się obwodami neuronowymi oraz mechanizmami synaptycznymi leżącymi u podstaw przetwarzania wzrokowego w siatkówce. Laboratorium Morgansa bada molekularne mechanizmy adaptacji do światła w komórkach dwubiegunowych. Laboratorium Sivyera interesuje się tym, jak neurony wewnętrzne siatkówki wpływają na funkcjonowanie komórek zwojowych.
Dostęp do neuronów wewnętrznej warstwy jądrowej w całej siatkówce jest wyzwaniem zarówno dla badań anatomicznych, jak i fizjologicznych. Neurony wewnętrznej warstwy jądrowej są dostępne w pionowych przekrojach, ale w polu widzenia jest bardzo niewiele neuronów. Ponadto cięcie odciętych bocznych procesów i połączeń może wpływać na badania fizjologiczne.
Usunięcie fotoreceptorów w technice rozdzielonej siatkówki znacząco poprawia dyfuzję przeciwciał do siatkówki wewnętrznej, co sprawia, że znakowanie immunologiczne celów wewnętrznych siatkówki jest ponad 20 razy szybsze w porównaniu do tradycyjnych całomontażowych siatkówek. Rozdzielona siatkówka znacznie poprawia także dostęp do neuronów wewnętrznej warstwy jądrowej podczas elektrofizjologii patch-clamp. Technika rozdzielonej siatkówki otworzy drzwi do nowych podejść i przyspieszy tempo naszych eksperymentów. Na przykład planujemy wykorzystać tę technikę do badania danych komórek dwubiegunowych do komórek zwojowe melanopsyny poprzez ekspresję kanałowej rodopsiny w komórkach dwubiegunowych.
Przy szerokim przejściu pipetą przenieś jedno oko myszy na nową szalkę Petriego z lodowatym, świeżym medium Amesa. Używając kleszczy, przypięj nadmiar tkanki łącznej do dna naczynia, aby ustabilizować oko. Teraz przebij oko wzdłuż linii ora serrata igłą 25, aby stworzyć punkt wejścia do nożyczek vanna.
Użyj nożyczek vannas, aby przeciąć ora serrata, aż rogówka się rozdzieli. Za pomocą kleszczy wyjmij soczewkę z oku, a następnie użyj szerokiej pipety transferowej, aby przenieść miskę do misy zawierającej dużą ilość aktywnie węglowodanego Amesa. Przelej jedną miseczkę do szalki Petriego wypełnioną świeżym roztworem węglowodanowego Amesa.
Nożyczkami Vanny zrób małe nacięcie do wewnątrz od krawędzi twardówki. Za pomocą dwóch par kleszczy ostrożnie odklej twardówkę od siatkówki. Teraz przetnij nerw wzrokowy łączący twardówkę z siatkówką, a następnie użyj nożyczek, aby delikatnie oderwać siatkówkę od twardówki, aby ją izolować.
Następnie skalpelem przetnij siatkówkę na pół lub ćwiartki. Używając pipety z szerokim ustkiem, umieść fragmenty siatkówki w dużej ilości nieprzerwanie karbogenizowanego medium Amesa. Powtórz sekcję siatkówki drugiego oka przed rozszczepieniem siatkówki.
Zacznij od zastąpienia podłoża Amesa z szalki Petriego, która zawierała siatkówkę myszy, na świeżą dawkę węglowodanowego Amesa. Użyj pipety do transferu z szerokim pyskiem, aby umieścić fragment rozciętej siatkówki myszy na szklanym szkiełku, z komórką zwoju do góry. Usuń nadmiar płynu delikatną ściereczką, aby ją spłaszczyć.
W razie potrzeby użyj cienkiego pędzla, aby delikatnie pociągnąć krawędzie siatkówki pod mikroskopem sekcyjnym. Użyj kleszczy, aby przyłożyć suchy kawałek błony nitrocelulozowej na siatkówkę, przyklejając go do strony komórek zwojowych. Odwróć siatkówkę, aby położyć nitrocelulozę na szklanym szkiełku i umieść kolejny suchy element błony po stronie fotoreceptora siatkówki.
Teraz zwilż czubek pędzla mediem Ames. Delikatnie naciskaj w dół na górną błonę, aby zapewnić równomierne przyleganie. Następnie przypiń dolną błonę do szkła jedną parą kleszczy, a następnie ostrożnie użyj drugiej pary, aby powoli i równomiernie odklejać górną błonę.
Pozbądź się górnej błony, która zawiera fotoreceptory. Na koniec należy zwrócić dolną błonę zawierającą wewnętrzną siatkówkę do karbogenezowanego ośrodka Amesa. Zacznij od zanurzenia rozszczepionej siatkówki myszy z przymocowanymi błonami nitrocelulozowymi w 4% paradehydu na lodzie przez 30 minut.
Następnie zastąp paraformaldehyd pięciodo do dziesięciu mililitrów PBS w temperaturze pokojowej, aby przemyć rozszczepione siatkówki. Przed usunięciem rozszczepionej siatkówki z nitrocelulozy, użyj hydrofobowego pióra barierowego, aby przygotować okrągłe dołki na szkiełku mikroskopowym. Pozwól studniom wyschnąć na powietrzu przez pięć do dziesięciu minut. Następnie umieść rozszczepione siatkówki w przygotowanych dołkach i dodaj wystarczająco dużo PBS, by je zanurzył.
Pod mikroskopem sekcyjnym delikatnie unieś krawędzie tkanki cienkim pędzlem i okrąż siatkówkę, aby oddzielić ją od błony. Użyj kleszczy i pędzla, aby usunąć błonę spod unoszącej się części siatkówki. Następnie ostrożnie zasysaj pozostałe PBS tak, aby tkanka siatkówki spoczywała na szkiełku mikroskopu, z komórką zwojową do dołu.
Znakowanie immunofluorescencyjne synaptofizyny na górze rozdzielonej siatkówki wskazało, że zakończenia synaptyczne fotoreceptorów zostały zachowane. Jednak jądra fotoreceptorów były nieobecne, co potwierdza, że siatkówka rozdzieliła się przez aksony fotoreceptorów. Integralność synapcji oceniono poprzez znakowanie RGS11 w dendrytach nie-BC oraz CtBP2 w wstążkach synaptycznych fotoreceptorów.
Rozszczepienie nie uszkodziło morfologii zakończeń fotoreceptorowych w zewnętrznej warstwie pleksiformnej. Żywotność RBC w rozdzielonej siatkówce oceniono za pomocą barwnika jądrowego w bliskiej podczerwieni. Regionalna zmienność żywotności komórek w tkankach została zaobserwowana przy wyższej śmierci komórek w niektórych obszarach, przy czym większość czerwonych krwinek pozostaje żywotna po rozszczepieniu.
Znakowanie immunofluorescencyjne antykrwinek przeciwko komórkom alfa PKC oraz poziomym przeciwko kalbendynie-D wykazało szybką dyfuzję przeciwciał w rozdzielonej siatkówce po godzinnej inkubacji.
Przegląd
Niniejsze badanie wprowadza nowatorską metodę przygotowania siatkówki w preparacie płaskim (flatmount), która zwiększa dyfuzję przeciwciał i ułatwia lepszy dostęp do neuronów wewnętrznych warstw siatkówki. Technika ta znacząco poprawia efektywność eksperymentów z zakresu immunohistochemii, hybrydyzacji in situ oraz elektrofizjologii.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia siatkówki
- Elektrofizjologia
Wstęp
- Laboratorium Morgansa bada mechanizmy adaptacji do światła w komórkach bipolarnych.
- Laboratorium Sivyera koncentruje się na neuronach wewnętrznej warstwy siatkówki i ich roli w funkcjonowaniu komórek zwojowych.
- Tradycyjne techniki preparatów całych (whole mount) stanowią wyzwanie w badaniu neuronów wewnętrznej warstwy jądrowej.
- Usunięcie fotoreceptorów umożliwia lepszy dostęp i skraca czas znakowania przeciwciałami.
Cel badania
- Opracowanie metody umożliwiającej szybszy dostęp do neuronów wewnętrznych warstw siatkówki.
- Poprawa wydajności immunoznakowania oraz eksperymentów elektrofizjologicznych.
- Dalsze badanie wkładów komórek bipolarnych do komórek zwojowych zawierających melanopsynę.
Zastosowane metody
- Do przygotowania siatkówki w formie płaskiego preparatu (flatmount) wykorzystano technikę dyssekcji siatkówki ex vivo.
- Model biologiczny obejmował wypreparowanie siatkówki z oczu myszy, co umożliwiło dostęp do neuronów wewnętrznej warstwy ziarnistej.
- Do analizy zastosowano techniki immunofluorescencji oraz elektrofizjologii.
- Kluczowe etapy obejmowały staranną dyssekcję, przemywanie w PBS oraz przeniesienie do nasyconego karbogenem medium Ames.
- Dyfuzję przeciwciał oceniono po jednej godzinie inkubacji.
Główne wyniki
- Zastosowanie nowej techniki sprawiło, że dyfuzja przeciwciał była ponad 20 razy szybsza niż w przypadku metod konwencjonalnych.
- W trakcie procesu przygotowania zachowano integralność synaptyczną fotoreceptorów.
- Po rozdzieleniu zaobserwowano regionalną zmienność żywotności komórek, przy czym większość komórek siatkówki pozostała żywa.
- Wyniki immunofluorescencji potwierdziły zachowanie zakończeń synaptycznych fotoreceptorów.
Wnioski
- Metoda ta umożliwia łatwiejszy dostęp do neuronów wewnętrznych warstw siatkówki w różnych podejściach eksperymentalnych.
- Zwiększa ona szybkość i wydajność immunoznakowania oraz badań fizjologicznych.
- Otrzymane wyniki mogą mieć znaczenie dla dalszych badań nad mechanizmami neuronalnymi w siatkówce.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Efektywny dostęp do neuronów wewnętrznej warstwy pleksiformowej siatkówki jest kluczowy dla minimalizacji ryzyka wczesnych etapów badań nad celami okulistycznymi oraz walidacji hipotez mechanistycznych w procesie odkrywania leków na choroby siatkówki. Przygotowanie preparatu z rozdzielonej siatkówki w układzie flatmount przyspiesza ilościowe znakowanie immunocytochemiczne i badania elektrofizjologiczne, zwiększając pewność predykcyjną w analizie szlaków neuronalnych. Możliwość ta usprawnia selekcję projektów w portfelu badawczym i zapewnia ciągłość translacyjną programów badań nad wzrokiem.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę obwodów komórek bipolarnych i horyzontalnych w celu weryfikacji mechanizmów i ograniczenia ryzyka błędów interpretacyjnych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez zachowanie bocznych połączeń neuronalnych.
- Ułatwia szybką weryfikację hipotez dotyczących mechanizmów synaptycznych istotnych dla przetwarzania bodźców wzrokowych.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Zapewnia zwalidowany system biologiczny do wysokoprzepustowego immunoznakowania i badań metodą patch-clamp.
- Poprawia powtarzalność testów poprzez zachowanie integralności synaptycznej i żywotności komórek.
- Dostarcza ilościowych wyników do przesiewowego badania wpływu związków na neurony wewnętrznej warstwy siatkówki.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami istotnymi dla chorób w badaniach nad obwodami siatkówki zaangażowanymi w zaburzenia widzenia.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć po walidację przedkliniczną dzięki wspieraniu wielu modalności analitycznych.
- Zmniejsza ryzyko wystąpienia wyników artefaktowych poprzez zachowanie połączeń fizjologicznych w modelu tkankowym.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejsza metoda stanowi pomost między wczesną fazą odkryć a badaniami przedklinicznymi, umożliwiając przeprowadzenie rzetelnych analiz funkcjonalnych i molekularnych neuronów wewnętrznej warstwy siatkówki.
- Biologia odkrywcza: Przyspiesza weryfikację hipotez dotyczących szlaków neuronalnych i mechanizmów synaptycznych.
- Przesiewy: Wspiera szybkie i powtarzalne immunoznakowanie oraz odczyty elektrofizjologiczne.
- Analityka: Zapewnia pomiary ilościowe dyfuzji przeciwciał i żywotności komórek na potrzeby badań porównawczych.
- Badania translacyjne: Utrzymuje istotne dla chorób obwody neuronalne do badań nad biomarkerami i mechanizmami.
- Zastosowania wielokrotne: Oferuje platformę wielokrotnego użytku dla różnorodnych badań siatkówki oraz aplikacji przesiewowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów siatkówkowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie dla powtarzalnych, skalowalnych procesów roboczych w różnych zespołach.
- Wartość strategiczna: Umożliwia szybsze podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne pod względem kapitałowym rozwijanie zasobów badawczych w dziedzinie wzroku.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów i modalności siatkówkowych z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie dyssekcji siatkówki i obchodzenia się z tkankami w celu uzyskania optymalnych wyników.
- Wymagany jest dostęp do aparatury do elektrofizjologii i immunofluorescencji.
- Niezbędna jest standaryzacja międzyzespołowa dla zapewnienia powtarzalności w badaniach wieloośrodkowych.
- Może być wymagana adaptacja metody dla różnych gatunków lub modeli chorobowych.
- Podczas wdrażania należy monitorować regionalną zmienność żywotności komórek.
