Multipleksowe barwienie immunohistochemiczne tkanki raka płuc zatopionej w parafinie
21 listopada 2023
Ten eksperymentalny protokół opisuje i optymalizuje metodę barwienia metodą immunohistochemii multipleksowej (IHC), głównie poprzez optymalizację warunków inkubacji przeciwciał jednokanałowych i dostosowanie ustawień przeciwciał i kanałów do rozwiązania problemów autofluorescencji i przesłuchu kanałowego w tkankach raka płuc pochodzenia klinicznego.
Nasze badania koncentrowały się na optymalizacji protokołu mIHC na wycinku parafiny uzyskanym ze źródeł klinicznych. Naszym celem było skuteczne rozwiązanie problemów z autofluorescencją i przesłuchami kanałów autofluorescencyjnych w tkance płucnej. Obecne wyzwania eksperymentalne, przed którymi stoimy, obejmują rozwiązanie problemów ultrafluorescencji i przesłuchów kanałowych w tkance płucnej, osiągając w ten sposób udaną lokalizację fluorescencji koloru, której potrzebują dla znakowanych komórek docelowych i białek.
Nasza wysoce wydajna metoda niwelacji wieloczynnikowego antygenu, która wymaga mniej niż trzech godzin na przeciwciało, bezproblemowo integruje system wielospektrometryczny i specjalistyczne oprogramowanie patologiczne. Ten zoptymalizowany protokół mIHC można łatwo dostosować do użytku w innych laboratoriach badawczych. Na początek należy zaopatrzyć się w wcześniej przygotowaną formułę oraz utrwalone i zatopione w parafinie szkiełko z próbką tkanki raka płuc.
Inkubuj w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut. Przeprowadzić odwodnienie, zanurzając szkiełko w ksylenie, a następnie w roztworach etanolu o malejących stężeniach. Następnie zanurz szkiełka w wysterylizowanej wodzie trzy razy na minutę każda.
W celu pobrania antygenu umieść szkiełko w pudełku do barwienia i naprawy. Napełnij go immunohistochemicznym roztworem roboczym buforu naprawczego antygenu o pH sześć lub dziewięć. Przykryj pudełko pokrywką i podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez osiem minut przy 100% mocy.
Następnie schłodzić szkiełko do temperatury pokojowej. Przykryj tkankę roztworem blokującym, a następnie inkubuj w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po usunięciu roztworu blokującego przykryj szkiełko pierwotnym roztworem roboczym przeciwciała i umieść je w wilgotnej komorze.
Następnie inkubuj tę komorę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie umyj szkiełko roztworem roboczym buforu myjącego przez dwie minuty. Dodaj polimerową peroksydazę chrzaku bezpośrednio kroplami na szkiełko i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
Po umyciu szkiełka należy dodać roztwór roboczy fluoroforu bezpośrednio kroplami na szkiełko i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po umyciu szkiełka należy poddać je działaniu mikrofal, jak pokazano wcześniej. Gdy szkiełko zostanie schłodzone do temperatury pokojowej, umyj je trzy razy wodą podwójnie destylowaną przez jedną minutę każdy.
Następnie zanurzyć szkiełko w roztworze roboczym buforu płuczącego na dwie minuty i przeprowadzić inkubację przeciwciał, peroksydazę chrzanowa i dodanie fluoroforu, jak pokazano. W przypadku barwienia jądra komórkowego przykryj szkiełko roztworem roboczym DAPI i inkubuj je w wilgotnej komorze przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj szkiełka podwójnie destylowaną wodą trzy razy po jednej minucie.
Usuń kropelki wody ze zjeżdżalni. Dodać od 10 do 20 mikrolitrów środka antyfluorescencyjnego do szkiełka i uszczelnić je szkłem nakrywkowym mikroskopu. Na początek należy zaopatrzyć się w przygotowane wcześniej barwione preparaty z próbkami tkanki raka płuc.
Aby automatycznie skanować zabarwione szkiełka, należy ręcznie ustawić czas naświetlania i program skanowania dla każdego kanału fluorescencji. Przeciągnij plik wielokolorowego obrazu fluorescencji uzyskany z oryginalnego skanu do oprogramowania i ustaw typ obrazu na Fluorescencja. Kliknij przycisk Kontrast jasności i sprawdź kanały na panelu.
Kliknij na zewnątrz, a następnie na kanale, aby wybrać interesujący Cię kanał fluorescencyjny. Przeciągnij minimalne i maksymalne wyświetlanie, aby dostosować jasność i kontrast każdego kanału. Po określeniu widoku do zapisania kliknij Pokaż przegląd slajdu i Pokaż położenie kursora, aby usunąć te dwie treści i zachować pasek skali.
Kliknij filet, a następnie Eksportuj migawkę i bieżącą zawartość przeglądarki, aby wyeksportować plik PNG. Niedrobnokomórkowe tkanki płaskonabłonkowe raka płuca wykazały, że makrofagi i limfocyty T CD8-dodatnie znacząco infiltrowały wokół i wewnątrz ognisk raka. Białko HMGCS1 wykazywało szeroką ekspresję w osoczu komórek raka płaskonabłonkowego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół eksperymentalny opisuje zoptymalizowaną metodę wielokrotnego barwienia immunohistochemicznego (IHC) dla tkanek raka płuca. Głównym celem jest rozwiązanie problemów związanych z autofluorescencją oraz przesłuchami kanałów (crosstalk) w celu poprawy wizualizacji docelowych komórek i białek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Patologia
- Immunohistochemia
Wstęp
- Multipleksowa immunohistochemia (mIHC) jest kluczowa dla badania złożonych próbek tkanek.
- Autofluorescencja może zacierać wyniki w obrazowaniu fluorescencyjnym.
- Przesłuchy między kanałami komplikują interpretację obrazów wielokanałowych.
- Optymalizacja protokołów barwienia może poprawić przejrzystość wyników.
Cel badania
- W celu optymalizacji protokołu mIHC dla tkanek raka płuca.
- W celu skutecznego wyeliminowania autofluorescencji i przesłuchów między kanałami.
- W celu opracowania metody, która będzie możliwa do adaptacji w innych laboratoriach badawczych.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie próbek tkanki raka płuca zatopionych w parafinie.
- Optymalizacja warunków inkubacji przeciwciał w jednym kanale.
- Integracja wielospektralnego systemu detekcji.
- Zastosowanie specjalistycznego oprogramowania patomorfologicznego do analizy.
Główne wyniki
- Skuteczna redukcja autofluorescencji i przesłuchów między kanałami.
- Wydajny proces barwienia wymagający mniej niż trzech godzin na jedno przeciwciało.
- Poprawiona lokalizacja znakowanych komórek docelowych i białek.
- Protokół wykazujący zdolność adaptacji do różnych warunków laboratoryjnych.
Wnioski
- Zoptymalizowany protokół mIHC znacznie poprawia klarowność obrazowania.
- Zniwelowanie autofluorescencji i przesłuchu sygnałów (crosstalk) jest kluczowe dla uzyskania dokładnych wyników.
- Metoda ta może ułatwić dalsze badania w zakresie patologii raka płuca.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Multiplexowa immunohistochemia (mIHC) umożliwia wysokotreściowe profilowanie przestrzenne ekspresji białek w tkankach raka płuca zatopionych w parafinie, odpowiadając na złożoność mikrośrodowiska guza. Dzięki eliminacji autofluorescencji i przesłuchów kanałów, niniejszy protokół zwiększa wiarygodność mapowania typów komórek i szlaków sygnałowych, co jest kluczowe dla wczesnego odkrywania oraz badań translacyjnych. Metoda ta wspiera solidną walidację celów terapeutycznych i ocenę biomarkerów, dostarczając informacji niezbędnych do podejmowania decyzji strategicznych w obszarze badawczo-rozwojowym onkologii.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia analizę z rozdzielczością przestrzenną koekspresji białek w mikrośrodowiskach nowotworowych.
- Wspiera walidację funkcjonalną potencjalnych celów terapeutycznych poprzez detekcję multipleksową.
- Poprawia ocenę ryzyka mechanistycznego poprzez wyjaśnienie interakcji międzykomórkowych in situ.
- Ułatwia zwiększenie pewności prognostycznej w wyborze szlaków i celów dla programów onkologicznych.
Przesiew i opracowanie testu
- Zapewnia zwalidowane systemy tkankowe do dalszego rozwoju testów multipleksowych.
- Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki dotyczące lokalizacji i zawartości białek.
- Umożliwia standaryzację procesów barwienia multipleksowego w różnych zespołach badawczych.
- Wspiera przygotowanie do skriningu na platformach do wysokoprzepustowej analizy tkanek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne ze strategiami biomarkerów translacyjnych poprzez walidację ekspresji białek w próbkach klinicznych.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej dzięki analizom patologii przestrzennej.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne poprzez potwierdzenie w obrębie tkanki (in situ) sygnatur białkowych istotnych dla przebiegu choroby.
- Wspiera integrację z danymi z sekwencjonowania wysokoprzepustowego i proteomiki w celu przeprowadzenia kompleksowej walidacji.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół mIHC znajduje zastosowanie na każdym etapie – od wczesnej fazy odkryć po badania translacyjne, łącząc walidację celu, opracowywanie testów oraz dopasowanie biomarkerów przedklinicznych w procesach badawczych w onkologii.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez i wyjaśnienie szlaków sygnałowych poprzez multipleksową detekcję białek w tkankach nowotworowych.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki służące do standaryzacji testów i oceny związków chemicznych.
- Analityka: Generuje wysokotreściowe dane przestrzenne do analizy porównawczej populacji komórek i ekspresji białek.
- Badania translacyjne: Pozwala na walidację biomarkerów istotnych dla przebiegu choroby i wspiera integrację ze zbiorami danych omicznych.
- Ponowne wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Oferuje skalowalny i adaptowalny protokół dla różnych typów tkanek oraz warunków badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów terapeutycznych i biomarkerów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne i skalowalne przepływy pracy dla barwienia multipleksowego.
- Wartość strategiczna: Poprawia procesy podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie uzyskania rzetelnych informacji z zakresu biologii przestrzennej.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów w obszarze onkologii.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie immunohistochemii oraz analizy obrazowania fluorescencyjnego.
- Wymaga dostępu do wielospektralnych systemów obrazowania i specjalistycznego oprogramowania patomorfologicznego.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalności protokołu i porównywalności danych.
- Możliwość adaptacji do różnych typów tkanek zatopionych w parafinie poprzez optymalizację protokołu.
- Konieczność uwzględnienia autofluorescencji oraz przesłuchów między kanałami (crosstalk) w celu dokładnej detekcji multipleksowej.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:17
Optimizing Multiplex Immunohistochemistry (mIHC) Staining for Lung Cancer Tissue Samples to Address Autofluorescence Issues
3:38
Analyzing Fluorescence in Lung Cancer Tissue Samples Stained with Optimized Multiplex Immunohistochemistry (mIHC) Technique
