Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej z tętnic szyjnych myszy do sekwencjonowania pojedynczych komórek
19 stycznia 2024
Tutaj opisujemy dwuetapowy protokół trawienia komórkowego do przygotowania jednokomórkowego zawieszenia tętnic szyjnych myszy.
Niska żywotność komórkowa i większe szczątki komórkowe to główne trudności w dysocjacji tkanki naczyniowej. Nasza dwuetapowa metoda trawienia komórkowego jest bardzo odpowiednia do dysocjacji tkanek szyjnych i może być stosowana do przygotowywania zawiesin jednokomórkowych dla innych naczyń z niewielkimi modyfikacjami, co czyni ją bardzo pomocną w badaniach sercowo-naczyniowych. Protokół ten jest odpowiedni do uzyskiwania wielu typów komórek w tętnicy szyjnej i można go łatwo powtórzyć bez specjalnego sprzętu.
W przyszłości zamierzamy wykorzystać subkulturę komórkową odkrytą dzięki sekwencjonowaniu żelaza w pojedynczych komórkach do celowanej terapii chorób sercowo-naczyniowych. Na początek spryskaj uśpioną mysz 75% alkoholem. Następnie użyj wysterylizowanych nożyczek preparacyjnych, aby otworzyć skórę i odsłonić jamę klatki piersiowej.
Wytnij membranę. Następnie kontynuuj cięcie w górę w kierunku dolnej szczęki i ostrożnie usuń nadmiar tkanki łącznej i tłuszczu, odsłaniając tętnicę szyjną. Następnie przetnij żyłę główną dolną, aby krew wypłynęła z zamkniętego krążenia.
Za pomocą strzykawki powoli wstrzyknąć 20 mililitrów wstępnie schłodzonego roztworu perfuzyjnego do lewej komory. Umieść mysz pod mikroskopem stereoskopowym, a następnie za pomocą nożyczek do mikropreparowania oderwij tłuszcz i tkankę łączną wokół tętnicy szyjnej. Odizoluj tętnicę szyjną i przemyj ją PBS, aby wypłukać resztki krwi.
Przenieś tętnicę na sześciodołkową płytkę zawierającą 1,5% FBS na lodzie. Za pomocą nożyczek do mikropreparowania wypreparuj tętnicę szyjną wzdłużnie i umieść ją płasko na nowej sześciodołkowej płytce zawierającej jeden mililitr FBS na lodzie. Ostrożnie przepłucz błonę wewnętrzną tętnicy FBS, aby usunąć resztki krwi.
Przetnij tętnicę na dwa milimetrowe kwadratowe kawałki tkanki i przenieś je do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Wirować przy 400 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zanurzyć tkanki na dnie. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić tkanki w 500 mikrolitrach odczynnika dysocjacyjnego A. Umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na jedną godzinę, delikatnie pipetując pipetą o pojemności jednego mililitra co 10 minut.
Następnie dodaj 500 mikrolitrów 5% FBS do probówki i dobrze wymieszaj. Przefiltruj zawiesinę komórek przez sterylne sitko do komórek o grubości 40 mikronów do probówki o pojemności 1,5 mililitra, a następnie odwiruj filtrat i usuń supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu w 200 mikrolitrach odczynnika dysocjacyjnego B. Umieść probówkę w łaźni wodnej, aby całkowicie zdysocjować komórki w zawiesinę jednokomórkową. Po pięciu minutach dodaj 200 mikrolitrów 5% FBS, aby zakończyć reakcję trawienia.
Odwirować zawiesinę i wyrzucić supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu w 100 mikrolitrach PBS na lodzie. Obserwacje mikroskopowe wykazały, że połączenie odczynnika dysocjacyjnego B z odczynnikiem A prowadziło do dokładniejszej dysocjacji tkanki tętnicy szyjnej w porównaniu z użyciem samego odczynnika dysocjacyjnego A. W sumie 176 000 pojedynczych komórek pobrano z dziewięciu lewych tętnic szyjnych, przy czym większość naczyń krwionośnych została z powodzeniem zdysocjowana na pojedyncze komórki o wysokiej żywotności.
Po trawieniu, nienadzorowane grupowanie oparte na CIARA ujawniło cztery główne typy komórek w normalnych tętnicach szyjnych myszy.
Przegląd
Niniejsze badanie odnosi się do problemów niskiej żywotności komórek oraz obecności dużych ilości debris komórkowego podczas dysocjacji tkanek naczyniowych, przedstawiając dwuetapowy protokół trawienia komórek opracowany specjalnie dla tętnic szyjnych myszy. Protokół ten pozwala na uzyskanie zawiesiny pojedynczych komórek o wysokiej żywotności, która może zostać zaadaptowana do innych naczyń, co przyczynia się do rozwoju technik w badaniach sercowo-naczyniowych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Badania nad układem sercowo-naczyniowym
- Metody dysocjacji komórek
- Analiza pojedynczych komórek
Wstęp
- Typowe problemy podczas dysocjacji tkanki naczyniowej obejmują niską żywotność komórek oraz obecność dużych ilości zanieczyszczeń.
- Skuteczne metody dysocjacji są kluczowe dla badania różnych typów komórek w obrębie naczyń krwionośnych.
- Poprzednie protokoły mogły charakteryzować się brakiem elastyczności lub wymagać specjalistycznego sprzętu.
Zastosowane metody
- Dwuetapowe enzymatyczne trawienie komórek
- Tętnice szyjne myszy
- Techniki filtracji i wirowania
Główne wyniki
- Z tętnic szyjnych myszy pomyślnie pobrano 176 000 pojedynczych komórek.
- Protokół zwiększył wydajność dysocjacji oraz żywotność komórek.
- Grupowanie nienadzorowane pozwoliło zidentyfikować cztery główne typy komórek w tętnicach szyjnych.
Wnioski
- Badanie przedstawia skuteczny protokół przygotowania zawiesin pojedynczych komórek z tętnic szyjnych.
- Metodologia ta ma zastosowanie w terapiach celowanych w chorobach układu sercowo-naczyniowego.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Zawiesiny pojedynczych komórek o wysokiej żywotności, otrzymywane z tętnic szyjnych myszy, umożliwiają precyzyjne profilowanie komórkowe, które jest kluczowe dla walidacji celów sercowo-naczyniowych oraz mechanistycznego ograniczania ryzyka. Niniejszy protokół rozwiązuje kluczowy problem w procesach sekwencjonowania pojedynczych komórek naczyniowych, zwiększając pewność prognostyczną we wczesnych fazach odkryć oraz w badaniach translacyjnych. Jego powtarzalność i adaptacyjność sprawiają, że stanowi on wielokrotnie wykorzystywalne narzędzie w ramach procedur biologii naczyniowej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biopharmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie heterogeniczności komórkowej w tkankach naczyniowych w celu walidacji celów terapeutycznych.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez zapewnienie dostępu do wielu typów komórek naczyniowych.
- Ułatwia uzyskanie wiarygodnych wyników predykcyjnych w analizie szlaków sygnałowych i modelowaniu chorób.
Przesiewy i opracowanie testów
- Przygotowuje zawiesiny pojedynczych komórek o wysokiej żywotności, odpowiednie do późniejszych analiz sekwencjonowania pojedynczych komórek.
- Standaryzuje proces dysocjacji i ocenę żywotności w celu uzyskania powtarzalnych wyników ilościowych.
- Umożliwia wiarygodną ocenę odpowiedzi specyficznych dla danego typu komórek w platformach przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z układami istotnymi dla przebiegu chorób, obejmując różnorodne populacje komórek naczyniowych.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć po walidację przedkliniczną w badaniach nad układem sercowo-naczyniowym.
- Stanowi podstawę do translacyjnej identyfikacji biomarkerów w modelach chorób naczyniowych.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Niniejszy protokół integruje się z continuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając rzetelną analizę pojedynczych komórek tkanek naczyniowych, co wspiera zarówno walidację celów terapeutycznych, jak i badania translacyjne.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia weryfikację hipotez i wyjaśnienie szlaków komórkowych w układach naczyniowych.
- Przesiewanie: Pozwala na uzyskanie powtarzalnych zawiesin o wysokiej żywotności do ilościowych analiz pojedynczych komórek.
- Analityka: Dostarcza wskaźniki żywotności i koncentracji komórek w celu porównania warunków dysocjacji.
- Badania translacyjne: Umożliwia wykrywanie wielu typów komórek naczyniowych w celu dopasowania biomarkerów.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Protokół adaptowalny do innych tkanek naczyniowych po wprowadzeniu niewielkich modyfikacji.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność w profilowaniu komórek naczyniowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje dysocjację i ocenę żywotności dla skalowalnych przepływów pracy.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez umożliwienie solidnej charakterystyki komórkowej.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko w potokach badawczych nad układem sercowo-naczyniowym.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w technikach sekcji tkanek oraz dysocjacji enzymatycznej.
- Wymagane jest standardowe wyposażenie laboratoryjne do perfuzji, wirowania i liczenia komórek.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów oceny żywotności i stężenia komórek pomiędzy zespołami.
- Metoda jest adaptowalna do innych tkanek naczyniowych po optymalizacji protokołu pod kątem specyficznych właściwości tkanki.
- Żywotność komórek oraz usuwanie zanieczyszczeń są kluczowe dla sukcesu późniejszego sekwencjonowania pojedynczych komórek.
