Hybrydyzacja Reakcja łańcuchowa RNA Cała góra Fluorescencja in situ Hybrydyzacja genów chemosensorycznych w przydatkach węchowych komarów
17 listopada 2023
Artykuł opisuje metody i odczynniki niezbędne do przeprowadzenia hybrydyzacji, reakcji łańcuchowej, fluorescencji RNA, hybrydyzacji in situ (HCR, RNA, WM-FISH), aby ujawnić wgląd w przestrzenną i komórkową rozdzielczość genów receptorów chemosensorycznych w czułku komara i palpie szczękowym.
Nasza grupa interesuje się systemem chemosensorycznym komarów. Mamy nadzieję, że celując w zmysł smaku i węchu komara, możemy powstrzymać go przed znalezieniem nas i ugryzieniem. Hybrydyzacja reakcji łańcuchowej fluorescencyjna hybrydyzacja in situ jest nowym osiągnięciem.
Technologia ta jest bardzo czuła, solidna i zdolna do multipleksowania kilku celów genowych, dzięki czemu możemy wizualizować ekspresję i lokalizację tych genów jednocześnie w ich naturalnym środowisku. Transkryptomika specjalna to najnowocześniejsza metoda stosowana w dziedzinie biologii przestrzennej. Technologia ta jest w stanie multipleksować kilka tysięcy genów i można jednocześnie wizualizować ekspresję tych genów.
Nasz protokół pozwala nam bezpośrednio wizualizować, które neurony w antenie wyrażają którykolwiek z około 50 możliwych receptorów jonotropowych. Daje nam to fundamentalną mapę drogową, która pomoże nam zrozumieć, w jaki sposób ta klasa receptorów czynników może pośredniczyć w zachowaniach. Neurony węchowe w narządach węchowych owada, takie jak antena, są zwykle zakopane w ochronnej chitynowej powłoce.
To sprawia, że wizualizacja ekspresji receptorów węchowych w tych neuronach jest bardzo trudna. Nasz protokół wykorzystuje połączenie leczenia chitynazami i najnowocześniejszym protokołem fluorescencji in situ, aby przezwyciężyć te wyzwania. Na początek podgrzej rozcięte głowy komarów Anopheles w buforze CCD w temperaturze 37 stopni Celsjusza na bloku grzewczym przez pięć minut.
Przenieś rurkę z główkami komarów do pieca do hybrydyzacji w celu obracania w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie przenieś całą zawartość rurki do szkiełka do zegarka preparacyjnego. Za pomocą kleszczy podnieś główki lub odłączone czułki i zamocuj je w jednym mililitrze utrwalacza.
W nutatorze obracaj głowice w utrwalaczu wstępnym przez 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić sekcję tkanek, najpierw opłucz głowy jednym mililitrem 0,1% PBS Tween na lodzie. Następnie przenieś głowice do szkiełka do preparacji.
Pod mikroskopem preparacyjnym usuń interesujące Cię tkanki z głowy za pomocą ostrych kleszczy. Przytrzymaj przednią część głowy kleszczami i chwyć antenę innymi kleszczami od podstawy. Podobnie, usuń palpy, przenieś czułki i palpy do pustych probówek wolnych od DNRNaz umieszczonych na lodzie.
Odwodnić tkankę w 400 mikrolitrach odczynnika odwadniającego przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie zastąp odczynnik odwadniający 400 mikrolitrami metanolu absolutnego i odwodnij tkanki przez noc w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Po zakończeniu utrwalania należy ponownie nawodnić tkanki w czteroetapowej serii stopniowanych roztworów nawadniających przez 10 minut na lodzie.
Następnie umyj chusteczki w 400 mikrolitrach PBST przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Inkubować tkanki w 400 mikrolitrach roztworu proteinazy K przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Umyj tkanki dwa razy w 400 mikrolitrach PBST, aby zatrzymać trawienie enzymatyczne.
Po dodaniu utrwalacza po ponownym umyciu tkanki PBST przed hybrydyzacją sondy. Zanurz tkankę w 400 mikrolitrach buforu hybrydyzacyjnego sondy na pięć minut. Następnie usuń bufor i wstępnie zhybrydyzuj tkankę w 400 mikrolitrach podgrzanego buforu do hybrydyzacji sondy przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Zastąp podgrzany bufor hybrydyzacyjny sondy 400 mikrolitrami podgrzanego roztworu sondy. Umieść probówkę w nutatorze na dwie noce w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie umieść nutator w inkubatorze pokrytym pudełkiem.
Następnie zindywiduanować tkankę w 400 mikrolitrach buforu do przemywania sondy w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze. Po umyciu tkanek w pięciokrotnym SSCT, inkubować w 400 mikrolitrach buforu amplifikacyjnego przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odpipetować bufor wzmacniający z probówki.
Następnie dodaj mieszankę podgrzanych spinek do włosów H1 i H2. Następnie odpipetować sto mikrolitrów buforu amplifikacyjnego. Nutuj tkankę przez noc w ciemności w temperaturze pokojowej. Aby zamontować chusteczkę, najpierw umieść pięć kropli roztworu montażowego na szklanym szkiełku.
Następnie za pomocą kleszczy chwyć umyte próbki tkanek za ich podstawę. Delikatnie zanurz i spłucz w serii kropelek roztworu montażowego. Następnie zamontuj za pomocą roztworu montażowego i umieść szkiełko nakrywkowe na chusteczce.
Uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci przed obrazowaniem. Analizy HCR-FISHed tkanki węchowej samicy komara Anopheles wykazały, że IR41t. 1, IR75d i IR7t były mniej obfite w czułkach.
IR64a był trzy razy liczniejszy niż reszta genów kandydujących. Kolokalizację rodzin receptorów Orco i IR25a zaobserwowano w czułce, a także w palpie szczękowym komara. Wzorce kolokalizacji sugerują, że komórki dodatnie IR76b wyrażają IR25a, podczas gdy komórki dodatnie IR8a częściowo kolokalizują się z IR76b i IR25a.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół hybrydyzacji łańcuchowej RNA w metodzie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w całych preparatach (HCR RNA WM-FISH), mający na celu wyjaśnienie przestrzennej i komórkowej ekspresji genów receptorów chemosensorycznych w czułkach i czułkach szczękowych komarów. Dzięki zastosowaniu zaawansowanych technik fluorescencyjnych badanie to rzuca światło na systemy chemosensoryczne oraz ich potencjalny wpływ na zachowanie komarów i ich interakcje z środowiskiem.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biotechnologia
- Entomologia
Wprowadzenie
- System chemosensoryczny komarów ma kluczowe znaczenie dla ich zachowania.
- Techniki reakcji łańcuchowej hybrydyzacji umożliwiają multipleksową wizualizację ekspresji genów.
- Wizualizacja receptorów węchowych jest trudna ze względu na ograniczenia anatomiczne.
- Obróbka chitynazą pomaga w pokonaniu barier w wizualizacji tkanek.
Cel badania
- Opracowanie metody jednoczesnej wizualizacji wielu genów receptorów chemosensorycznych.
- Przedstawienie informacji na temat lokalizacji i wzorców ekspresji tych receptorów.
- Ułatwienie lepszego zrozumienia zachowań sensorycznych u komarów.
Zastosowane metody
- Protokół wykorzystuje techniki RNA WM-FISH oparte na reakcji łańcuchowej hybrydyzacji.
- Jako model biologiczny wykorzystano komary z rodzaju Anopheles.
- Nie wspomniano o żadnych specyficznych przepływach pracy z zakresu multiomiki.
- Kluczowe etapy obejmują fiksację tkanek, odwodnienie oraz hybrydyzację, z precyzyjnie określonymi czasami inkubacji w różnych temperaturach.
- Obrazowanie następuje po zamontowaniu preparatów w celu ich wizualizacji.
Główne wyniki
- Wyjaśniono wzorce ekspresji kilku receptorów jonotropowych w czułkach komara.
- Zaobserwowano istotne różnice w liczbie receptorów, przy czym receptor IR64a wykazywał znacznie wyższy poziom ekspresji.
- Kolokalizacja różnych rodzin receptorów wskazała na złożone interakcje w obrębie tkanek chemosensorycznych.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia sposobu, w jaki receptory te pośredniczą w zachowaniach sensorycznych.
Wnioski
- Niniejsze badanie umożliwia głębsze zrozumienie systemów chemosensorycznych komarów dzięki zaawansowanym technikom wizualizacji.
- Opracowane metody mogą ułatwić dalsze badania nad rolą receptorów sensorycznych w zachowaniu komarów.
- Zdobyta wiedza może pomóc w opracowaniu strategii kontroli interakcji komarów z ludźmi.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Mapowanie przestrzenne ekspresji genów chemosensorycznych w narządach węchowych komarów umożliwia wysokorozdzielczą walidację celów dla strategii kontroli wektorów. Protokół HCR RNA WM-FISH zapewnia solidną, multipleksową detekcję ekspresji genów, co zwiększa pewność predykcyjną we wczesnej fazie odkrywania oraz pozwala na redukcję ryzyka mechanistycznego. Możliwość ta jest bezpośrednio istotna dla zespołów biofarmaceutycznych dążących do zbadania szlaków sensorycznych i priorytetyzacji celów molekularnych u owadów będących wektorami chorób.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępna faza odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia analizę ekspresji genów chemosensorycznych z rozdzielczością przestrzenną w tkankach natywnych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez mapowanie lokalizacji receptorów z rozdzielczością pojedynczych komórek.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez wyjaśnienie koekspresji receptorów i architektury szlaków.
- Dostarcza podstawowych danych do priorytetyzacji celów w szlakach sensorycznych w biologii wektorów.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane układy biologiczne do dalszego przesiewania modulatorów lub inhibitorów.
- Zapewnia ilościowe, powtarzalne wyniki z odczytem multipleksowym w celu standaryzacji testu.
- Umożliwia niezawodną detekcję wielu genów docelowych w ramach jednego procesu, wspierając skalowalność.
- Zwiększa gotowość do przesiewania poprzez potwierdzenie obecności i rozkładu przestrzennego celu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje przestrzenną ekspresję genów z istotnymi dla choroby zachowaniami sensorycznymi u gatunków wektorów.
- Wspiera ciągłość translacyjną, umożliwiając adaptację do innych modeli owadów lub tkanek.
- Zapewnia wartość prognostyczną dla badań przedklinicznych ukierunkowanych na szlaki chemosensoryczne.
- Ułatwia dostosowany do ryzyka rozwój kandydatów do kontroli wektorów w oparciu o dowody molekularne.
Integracja potoków i przepływów pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w kontinuum odkryć, od wczesnej walidacji celu, poprzez opracowanie testów, aż po badania translacyjne w biologii wektorów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez mapowanie ekspresji genów in situ.
- Przesiewanie: Potwierdza gotowość i powtarzalność testu dzięki multipleksowym, ilościowym wynikom.
- Analityka: Zapewnia pomiary przestrzenne i ilościowe do porównywania ekspresji genów w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Umożliwia adaptację do innych modeli owadów, wspierając ciągłość programów ukierunkowanych na wektory.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku dla transkryptomiki przestrzennej w różnorodnych systemach biologicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w wyborze celu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne i skalowalne przepływy pracy w zakresie przestrzennej ekspresji genów.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji typu go/no-go i zwiększa efektywność kapitałową w badaniach i rozwoju (R&D) ukierunkowanych na wektory.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów w obrębie szlaków sensorycznych dla kontroli wektorów, z uwzględnieniem korekty o ryzyko.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu sekcji tkanek, transkryptomiki przestrzennej oraz obrazowania fluorescencyjnego.
- Niezbędny jest dostęp do pieców do hybrydyzacji, mikroskopów fluorescencyjnych oraz infrastruktury analitycznej.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w zakresie projektowania sond i protokołów obrazowania.
- Adaptacja do innych modeli owadów może wymagać optymalizacji protokołu pod kątem rodzaju i wielkości tkanki.
- Precyzja w obchodzeniu się z tkankami jest krytyczna ze względu na delikatność przydatków węchowych.
