Wzorcowanie komórek przy użyciu strategii magnetyczno-archimedesowej
2 lutego 2024
Ten protokół opisuje metodę tworzenia wzorców komórkowych bez tuszu, bez etykiet, niezależną od podłoża, opartą na efekcie magnetycznym Archimedesa.
Modelowanie komórek to intuicyjna i wydajna technologia do indywidualnych badań. Nasze badania mają na celu przedstawienie wszechstronnej, przyjaznej dla użytkownika i niedrogiej metody modelowania komórek, która mogłaby zostać odtworzona w większości laboratoriów biomedycznych. W porównaniu z innymi metodami, nasz protokół nie wymaga specjalistycznych umiejętności i sprzętu.
Ponadto rozwija się równolegle do znaków bez atramentu, bez etykiet, niezależnie od podłoża i umożliwia tworzenie wzorów o wysokiej przepustowości. Protokół wymaga tylko dwóch niezbędnych rzeczy: magnesów i środków kontrastowych na bazie gadolinu, które są łatwe do zdobycia w niskich cenach. Metoda modelowania komórek oparta na magnesach zapewnia wygodne rozwiązania dla pierwszego etapu różnych eksperymentów, w tym migracji komórek, biomimetycznej kohodowli wielokomórkowej, składania organoidów, badań biomateriałów i innych.
Aby rozpocząć, wybierz płaskie prostokątne magnesy, aby zmontować zestawy magnesów dla wzorów pasków. Wytnij dwie silikonowe płytki o grubości milimetra na prostokąty o wymiarach 2 na 8 na 30 milimetrów. Następnie zmontuj prostokątne magnesy i płytki silikonowe warstwa po warstwie.
W przypadku wzorów z matrycą punktową zmontuj miniaturowe magnesy cylindryczne, upewniając się, że każdy zestaw magnesów składa się z 36 cylindrycznych magnesów ułożonych w siatkę sześć na sześć. Aby przygotować urządzenie do hodowli komórkowej, użyj dziurkacza, aby utworzyć prostokątny otwór o wymiarach jeden na jeden centymetr w silikonowej płytce o grubości dwóch milimetrów. Przytnij silikonową płytkę wokół otworu, aby stworzyć okrągłą formę z otworem pośrodku.
W celu sterylizacji umieść formy w myjce ultradźwiękowej. Sterylizuj formy czystą wodą przez 10 minut. Następnie zastąp wodę 75% etanolem na 10 minut.
Suszyć formy w pudełku sterylizatora w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 60 minut. Następnie przymocuj wysterylizowaną silikonową formę do 25-milimetrowego okrągłego szkiełka szklanego i delikatnie dociśnij formę, aby silikon przylegał do szkła. Umieść zestawy magnesów na 6-dołkowej płytce i umieść urządzenie do hodowli komórkowej na zestawie magnesów.
Aby przygotować 30-milimolowy roztwór do wstrzykiwań Gd-DTPA, należy zmieszać 30 mikrolitrów Gd-DTPA z 470 mikrolitrami kompletnej pożywki do hodowli komórkowych. Aby stworzyć wzory komórek, odwiruj zawiesinę HUVEC o sile 200 G przez pięć minut i ponownie zawiesić osad w pożywce zawierającej Gd-DTPA. Po zliczeniu komórek dostosuj gęstość komórek do około dwa razy dziesięć do pięciu komórek na mililitr za pomocą pożywki zawierającej Gd-DTPA.
Delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową i dodaj 200 mikrolitrów do wnęki formy do hodowli komórkowych, aby uzyskać pełną płyn powierzchnię. Inkubuj płytkę przez trzy do sześciu godzin, aż komórki przylgną do podłoża. Po inkubacji zastąp pożywkę zawierającą Gd-DTPA kompletną pożywką hodowlaną i wyjmij urządzenie do hodowli komórkowej z zestawu magnesów.
Aby przygotować urządzenie do hodowli komórkowej do modelowania komórek w paski, zastąp grube płytki silikonowe z urządzenia cienkimi płytkami. Po utworzeniu wzoru pierwszego typu komórek, jak pokazano wcześniej, przesuń urządzenie do hodowli komórkowej o jeden milimetr od magnesów poniżej w prawo. Zastosuj tę samą procedurę tworzenia wzoru do drugiego typu komórek i przesuń trzecie urządzenie do hodowli komórkowej o jeden milimetr od magnesów poniżej w prawo.
Uformuj trzeci typ komórek, jak pokazano. Po ułożeniu wszystkich typów komórek umyj szkiełka dwukrotnie 200 mikrolitrami PBS. Na koniec zastąp PBS kompletną pożywką do hodowli komórkowych.
Testy żywotności przeprowadzone na HUVEC traktowanych Gd-DTPA przez 12 godzin nie wykazały znaczącego spadku żywotności komórek, z wyjątkiem 50-milimolowego Gd-DTPA, co spowodowało różnicę statystyczną, ale zachowało wskaźnik życia na poziomie około 90%W przypadku wielotypowego wzorca komórkowego wygenerowano trójdzielny wzór komórek z paskami obok siebie i koncentrycznymi układami kropek.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje wszechstronną, łatwą w użyciu i niedrogą metodę wzorowania komórek opartą na magnetycznym efekcie Archimedesa. Jest ona wolna od użycia tuszy i znaczników, niezależna od rodzaju podłoża i umożliwia wzorowanie wysokoprzepustowe.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Wzorowanie komórkowe
- Badania biomedyczne
- Manipulacja magnetyczna
Wprowadzenie
- Wzorowanie komórek jest niezbędne w wielu eksperymentach biologicznych.
- Tradycyjne metody często wymagają specjalistycznych umiejętności i sprzętu.
- Niniejsza metoda upraszcza ten proces dzięki wykorzystaniu ogólnodostępnych materiałów.
- Protokół został opracowany tak, aby można go było powtórzyć w większości laboratoriów biomedycznych.
Cel badania
- Przedstawienie wysokoprzepustowej metody wzorcowania komórek.
- Zapewnienie dostępnej alternatywy dla istniejących technik.
- Umożliwienie przeprowadzenia szeregu eksperymentów, w tym badań nad migracją komórek oraz montażem organoidów.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie magnesów do manipulacji komórkami.
- Zastosowanie środków kontrastowych opartych na gadolinie.
- Możliwości wysokoprzepustowego tworzenia wzorów.
- Podejście niezależne od rodzaju podłoża.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na efektywne wzorowanie komórek bez użycia tuszy lub znaczników.
- Wykazuje ona wszechstronność w różnych konfiguracjach doświadczalnych.
- Stanowi kosztowo efektywne rozwiązanie dla badań biomedycznych.
- Umożliwia prowadzenie badań nad migracją komórek oraz wielokomórkowymi kokulturami.
Wnioski
- Metoda wzorowania komórek oparta na magnesach jest łatwa w obsłudze i niedroga.
- Otwiera ona nowe możliwości badawcze w biologii komórki.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować badania nad biomateriałami oraz składanie organoidów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wzorcowanie komórek w oparciu o zasadę magnetyczno-archimedesową umożliwia precyzyjną i powtarzalną kontrolę przestrzenną pojedynczych oraz wielu typów komórek, co wspiera zaawansowane modelowanie in vitro w badaniach wczesnego etapu odkrywania oraz badaniach translacyjnych. Przepływ pracy, który nie wymaga użycia tuszu, znaczników ani specyficznego podłoża, zmniejsza bariery techniczne i koszty, ułatwiając szybką weryfikację hipotez oraz skalowalny rozwój testów. Zdolność ta zwiększa wiarygodność prognostyczną w badaniach nad zachowaniem komórek i przyspiesza selekcję projektów w kluczowych punktach zwrotnych procesu odkrywania.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia kontrolowany układ przestrzenny komórek na potrzeby badań mechanistycznych i analizy szlaków sygnałowych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów terapeutycznych poprzez ułatwienie przeprowadzania powtarzalnych testów migracji oraz kokultur.
- Zmniejsza niejednoznaczność biologiczną dzięki standaryzacji początkowego rozmieszczenia komórek we wszystkich eksperymentach.
- Zwiększa pewność prognostyczną w badaniach przesiewowych fenotypów na wczesnym etapie oraz podczas weryfikacji hipotez.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane, powtarzalne wzory komórkowe dla późniejszych wysokoprzepustowych procesów przesiewowych.
- Ułatwia standaryzację testów poprzez eliminację artefaktów związanych z tuszem lub etykietami oraz zależności od podłoża.
- Umożliwia skalowalne, równoległe tworzenie wzorów dla rzetelnej oceny związków i ponownego wykorzystania platformy.
- Wspiera ilościowe odczyty, zapewniając spójny początkowy rozkład komórek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia modelowanie złożonych architektur tkankowych i interakcji wielokomórkowych istotnych dla przebiegu chorób.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć po walidację przedkliniczną, wspierając montaż organoidów oraz badania nad biomateriałem.
- Zmniejsza ryzyko w procesie wdrażania rozwiązań translacyjnych poprzez dostarczenie fizjologicznie istotnych systemów in vitro.
- Ułatwia dopasowanie do biomarkerów translacyjnych dzięki kontrolowanym eksperymentom z kokulturami.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje etapy wczesnego odkrywania, opracowywania testów oraz badań translacyjnych, umożliwiając płynne przejście od weryfikacji hipotez do modelowania przedklinicznego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera badania oparte na hipotezach, umożliwiając precyzyjne rozmieszczanie komórek w celu analizy szlaków sygnałowych i mechanizmów.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne i skalowalne układy komórkowe, przygotowując je do analizy i umożliwiając uzyskanie ilościowych wyników przesiewowych.
- Analityka: Zapewnia standaryzowane rozkłady przestrzenne, co ułatwia wiarygodne porównywanie statystyczne warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z pracami przedklinicznymi, umożliwiając tworzenie złożonych modeli kokultur i organoidów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje szeroko stosowalną, niskokosztową funkcjonalność dla różnorodnych zespołów badawczo-rozwojowych i portfeli projektowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w testach komórkowych.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność, standaryzację i skalowalność w ramach procesów badawczo-rozwojowych (R&D).
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji o kontynuacji lub przerwaniu projektu (go/no-go) oraz efektywność kapitałową dzięki uzyskaniu wiarygodnych danych na wczesnym etapie.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów odkrywczych i translacyjnych.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymagana jest podstawowa wiedza z zakresu hodowli komórkowych oraz dostęp do standardowych magnesów laboratoryjnych i odczynników opartych na gadolinie.
- Minimalne wymagania dotyczące instrumentacji; kompatybilne z większością infrastruktury laboratoriów biomedycznych.
- Ujednolicenie procedur między zespołami jest ułatwione dzięki prostocie i powtarzalności protokołu.
- Możliwość adaptacji do różnych typów komórek i systemów modelowych, w tym formatów kokultury i organoidów.
- Kwestie żywotności dla konkretnych typów komórek i stężeń odczynników powinny zostać potwierdzone empirycznie.
