Badanie leukocytów peroksydazo-dodatnich w nasieniu
19 stycznia 2024
Ten artykuł przedstawia ekonomiczny i efektywny protokół badania leukocytów peroksydazo-dodatnich w nasieniu. Za pomocą systemu komputerowej analizy nasienia (CASA) stężenie leukocytów peroksydazo-dodatnich w nasieniu można uzyskać w ciągu łącznie 60 minut, skutecznie poprawiając wydajność laboratorium andrologicznego i andrologów.
Medycyna rozrodu mężczyzn jest moim głównym celem badawczym, a nasz protokół przede wszystkim zajmuje się kwestiami szybkości i kosztów analizy leukocytów peroksydazo-dodatnich w nasieniu. Nasienie jest z natury niejednorodne, co naprawdę wpływa na stabilność wyników badania nasienia. Dlatego ważne jest, aby przed badaniem upewnić się, że nasienie jest upłynnione i dokładnie wymieszane.
Nasz protokół łączy ręczne i automatyczne pomiary w celu obliczenia stężenia leukocytów poprzez wykorzystanie koncentracji plemników, co oszczędza czas i jest bardziej opłacalne w porównaniu z klasyfikacją liczenia leukocytów. Aby rozpocząć, zbierz odczynniki do przygotowania roztworu roboczego i umieść je w temperaturze pokojowej. Przygotuj również nieprzezroczystą butelkę do przechowywania roztworu roboczego i chroń go przed światłem.
Następnie przenieś 100 mikrolitrów roztworu chlorku amonu do nieprzezroczystej butelki z odczynnikiem za pomocą pipety transferowej o pojemności 200 mikrolitrów. Przenieść również 100 mikrolitrów roztworu EDTA sodu do butelki z odczynnikiem i wymieszać przez pipetowanie. Następnie dodać 900 mikrolitrów roztworu substratu ortotoluidyny do nieprzezroczystej butelki z odczynnikiem i delikatnie wymieszać przez pipetowanie.
Następnie przenieś pięć mikrolitrów roztworu nadtlenku wodoru do butelki z odczynnikiem. Za pomocą pipety transferowej o pojemności 1000 mikrolitrów delikatnie wymieszaj roztwór, pipetując. Aby przygotować próbki nasienia, włącz podstawkę o stałej temperaturze i podgrzej ją do 37 stopni Celsjusza.
Należy również wytarować wagę pod kątem masy pojemnika na bazie polimeru. Po otrzymaniu próbki nasienia zważyć próbkę i zanotować szczegółowe informacje, takie jak kod identyfikacyjny, czas pobrania, czas abstynencji na zewnętrznej ściance pojemnika na bazie polimeru. Następnie umieść próbkę nasienia na stojaku o stałej temperaturze w celu upłynnienia nasienia.
Pobrać próbkę nasienia do pipety na bazie polimeru i sprawdzać pod kątem upłynnienia co pięć minut przez 30 minut, aż próbka nasienia zostanie całkowicie upłynniona. Na początek należy upłynnić pobrane próbki ludzkiego nasienia i dokładnie je homogenizować za pomocą pipety Pasteura. Następnie przenieś 100 mikrolitrów próbki nasienia do probówki wirówkowej.
Do tej probówki dodaj 900 mikrolitrów roztworu barwiącego. Kilkakrotnie wymieszać przez pipetowanie i dokładnie homogenizować reagent. Umieść probówkę na dwuwymiarowej wytrząsarce w celu ciągłego mieszania przy 200 obr./min przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
W oczekiwaniu na reakcję stojącą należy przystąpić do analizy stężenia plemników za pomocą systemu CASA. Po włączeniu systemu kliknij dwukrotnie ikonę lunety SCA, aby otworzyć oprogramowanie aplikacji. Następnie dokładnie wymieszaj próbkę nasienia przez pipetowanie i przenieś do 10 mikrolitrów próbki w komorze zliczającej SCA.
Odczekaj 60 sekund, aż próbka nasienia przestanie dryfować. Następnie umieść komorę zliczającą SCA na uchwycie próbki systemu CASA. W oprogramowaniu aplikacyjnym Wprowadź informacje o pacjencie w oknie dialogowym.
Kliknij przycisk start, aby zarejestrować stężenie plemników w nasieniu. Następnie zatrzymaj wytrząsarkę po zakończeniu 30-minutowej reakcji barwienia. Przed analizą należy wymieszać zawartość probówki wirówkowej przez pipetowanie.
Przenieś do 10 mikrolitrów reagenta do komory zliczania plemników i przykryj ją dedykowanym szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Umieść komorę do liczenia plemników na stoliku mikroskopowym i włącz mikroskop optyczny. Następnie odczekaj 60 sekund, aż próbka reagenta przestanie dryfować.
Pod obiektywem 10x wyreguluj kurs i pokrętła precyzyjnej regulacji, aby wybrać pole view. Następnie przełącz się na soczewkę obiektywową 40x i obserwuj plemniki i leukocyty dodatnie pod względem peroksydazy. Użyj elektronicznego systemu licznika, aby policzyć co najmniej 200 plemników i liczbę leukocytów peroksydazo-dodatnich w kolorze brązowym.
Za pomocą tej techniki leukocyty dodatnie pod względem peroksydazy wybarwiono w próbce nasienia. Leukocyty dodatnie pod względem peroksydazy wykazywały brązowy odcień kontrastujący z niebarwionymi zwykłymi okrągłymi komórkami.
Przegląd
Niniejsza praca przedstawia ekonomiczny i wydajny protokół badania leukocytów wykazujących aktywność peroksydazy w nasieniu. Protokół ten łączy metody manualne i automatyczne w celu obliczenia stężenia leukocytów, co zwiększa efektywność laboratoriów andrologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Medycyna rozrodu mężczyzn
- Andrologia
- Protokoły laboratoryjne
Wstęp
- Analiza nasienia jest kluczowa dla oceny płodności mężczyzn.
- Nasienie jest heterogeniczne, co wpływa na stabilność analizy.
- Leukocyty peroksydazo-dodatnie są ważnymi wskaźnikami w nasieniu.
- Szybkość i koszt są istotnymi czynnikami w analizie nasienia.
Cel badania
- Opracowanie kosztowo efektywnego protokołu analizy leukocytów w nasieniu.
- Zwiększenie szybkości analizy nasienia.
- Poprawa dokładności pomiarów stężenia leukocytów.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie systemu komputerowej analizy nasienia (CASA).
- Przygotowanie roztworu roboczego do analizy.
- Pomiary manualne i automatyczne w celu obliczenia stężenia leukocytów.
- Zapewnienie prawidłowej upłynnienia i wymieszania próbek nasienia.
Główne wyniki
- Protokół umożliwia pomiar stężenia leukocytów w ciągu 60 minut.
- Wykazuje on zwiększoną wydajność w warunkach laboratoryjnych.
- Oszczędność kosztów w porównaniu z tradycyjnymi metodami oceny.
- Wyższa dokładność wyników dzięki dokładnemu przygotowaniu próbki.
Wnioski
- Opracowany protokół jest wydajny i ekonomiczny w analizie nasienia.
- Odpowiada on na kluczowe wyzwania występujące w laboratoriach andrologicznych.
- Przyszłe zastosowania mogą dodatkowo usprawnić ocenę zdrowia reprodukcyjnego mężczyzn.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Szybka i dokładna kwantyfikacja leukocytów wykazujących aktywność peroksydazy w nasieniu eliminuje krytyczne wąskie gardło w diagnostyce męskiej niepłodności oraz ocenie stanu zapalnego dróg rozrodczych. Niniejszy protokół wykorzystuje komputerową analizę nasienia (CASA), aby dostarczyć standaryzowane i powtarzalne wyniki w ciągu 60 minut, wspierając podejmowanie decyzji na wczesnym etapie w badaniach i rozwoju (R&D) w obszarze zdrowia reprodukcyjnego. Usprawniony proces roboczy zmniejsza niejednoznaczność w ocenie stanu zapalnego, umożliwiając bardziej pewną selekcję pacjentów i priorytetyzację portfela projektów w procesach badawczych w dziedzinie andrologii.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjną analizę mechanizmów zapalnych wpływających na funkcję plemników i płodność.
- Wspiera biologiczną minimalizację ryzyka poprzez odróżnienie rzeczywistej leukocytospermii od innych, wprowadzających w błąd typów komórek.
- Zwiększa pewność prognostyczną w odniesieniu do dalszych badań nad zaburzeniami układu rozrodczego mężczyzn.
Przesiewanie i rozwój testów analitycznych
- Ułatwia przygotowanie zwalidowanych próbek nasienia do wysokoprzepustowego przesiewu związków przeciwzapalnych lub modulujących płodność.
- Zapewnia zestandaryzowane, ilościowe oznaczenia liczby leukocytów, odpowiednie dla powtarzalności testów i porównań między laboratoriami.
- Umożliwia szybką realizację analiz, wspierając skalowalne procesy przesiewowe w badaniach andrologicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zgadza się z punktami końcowymi istotnymi dla choroby poprzez ilościowe określenie upośledzenia funkcji plemników wywołanego leukocytami.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej w modelach męskiej niepłodności i stanów zapalnych.
- Wspiera dostosowane do ryzyka wdrażanie potencjalnych interwencji ukierunkowanych na stany zapalne dróg rozrodczych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół integruje etap wczesnego odkrywania z badaniami przedklinicznymi, łącząc ocenę diagnostyczną z badaniami mechanistycznymi w zakresie zdrowia reprodukcyjnego mężczyzn.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących wpływu leukocytospermii na jakość i funkcje plemników.
- Przesiew: Zapewnia powtarzalne, ilościowe pomiary leukocytów na potrzeby opracowywania testów i oceny związków.
- Analityka: Dostarcza obiektywne odczyty do porównywania stanu zapalnego w różnych próbkach i warunkach.
- Badania translacyjne: Wspiera dopasowanie biomarkerów dla przedklinicznych modeli męskiej niepłodności i stanów zapalnych dróg płciowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia ustandaryzowaną, skalowalną zdolność dla bieżących portfeli badawczych w zakresie andrologii i zdrowia reprodukcyjnego.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad męską niepłodnością.
- Wartość operacyjna: Optymalizuje przetwarzanie próbek, skraca czas oczekiwania na wyniki i zwiększa powtarzalność.
- Wartość strategiczna: Umożliwia wcześniejsze i lepiej uzasadnione podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w procesach badawczo-rozwojowych w obszarze zdrowia reprodukcyjnego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację diagnostyków i terapii ukierunkowanych na stany zapalne męskiego układu rozrodczego z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z nasieniem, barwieniu oraz obsłudze systemu CASA.
- Wymaga dostępu do mikroskopii optycznej oraz infrastruktury do komputerowej analizy nasienia.
- Wymaga standaryzacji protokołów przygotowania próbek i interpretacji danych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest dostosowywalna do różnych typów próbek nasienia, lecz może wymagać optymalizacji w przypadku matryc niestandardowych.
- Potencjalne ograniczenia obejmują heterogeniczność próbek oraz konieczność rygorystycznej kontroli jakości podczas przygotowania odczynników.
