Bezkomórkowy system syntezy białek do budowy komórek syntetycznych

Wszystkie nasze badania koncentrują się na bezkomórkowej biologii syntetycznej. Obejmuje to oddolne składanie komórek syntetycznych, analizę funkcjonalną i strukturalną białek błonowych, inżynierię białkową przy jednoczesnym włączeniu aminokwasów niekanonicznych oraz bezkomórkową inżynierię metaboliczną. Obecnie, oprócz bezkomórkowej syntezy białek, urządzenia mikroprzepływowe poprzez mikrofabrykację poprzez miękką litografię, rozwój materiałów biokompatybilnych i ogólną sztuczną inteligencję są wiodącymi technologiami, które napędzają szybszy rozwój bezkomórkowej biologii syntetycznej.

Konfiguracja przedstawiona jako protokół tworzy prosty, ale solidny system, który jest dobrze dopasowany do różnych środowisk mikrokompartmentów, w tym kropelkowych GUV jako naszej bazy, co pokazaliśmy w naszych reprezentatywnych wynikach. W przyszłości skoncentrujemy się na rozwoju dostosowanych do potrzeb systemów bezkomórkowych, które umożliwiają montaż i integrację różnych modułowych systemów mimikry komórek w celu osiągnięcia ostatecznego celu, jakim jest zbudowanie minimalnej liczby komórek. Na początek uzyskaj wstępnie wyhodowane komórki i umyj je dwukrotnie 35 mililitrami wstępnie schłodzonego buforu S30 A. Zagnieź komórki i ponownie zawieś je w buforze S30 B. W celu rozbicia komórek przenieś zawiesinę komórek do metalowej komory rozrywającej z prasą francuską i zabezpiecz ją na platformie hydraulicznej za pomocą zamka bezpieczeństwa.

Włącz pompę hydrauliczną i rozpocznij zakłócenia. Kontroluj zawór wylotowy, aby zebrać zawiesinę ogniw w nowej rurce o pojemności 50 mililitrów, utrzymując ciśnienie na poziomie 17 000 funtów na cal kwadratowy. Odwirować powstały lizat w stężeniu 30 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zebrać supernatant.

Ponownie odwirować i inkubować zebrany supernatant z 0,3 objętości buforu do wstępnej inkubacji, delikatnie wstrząsając w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 80 minut. Powstałą mieszaninę spływającą przez dwie godziny dializuj w stosunku do dwóch litrów buforu C S30 przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odwirować dializowaną próbkę i poddzielić podwielokrotność supernatantu.

Próbki należy natychmiast błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie. Po granulowaniu hodowanych komórek ponownie zawiesić je w 30 mililitrach buforu T7 A. Rozbić komórki w jednym przejściu przez prasę francuską przy 15 000 funtów na cal kwadratowy i odwirować lizat, aby usunąć resztki komórek. Dodawać siarczan streptomycyny kropla po kropli do supernatantu, aby osiągnąć końcowe stężenie 4%Po krótkiej inkubacji na lodzie odwirować lizat jak poprzednio.

Przefiltrowane próbki należy załadować do kolumny z mocną wymianą anionową. Po umyciu kolumny należy wymyć próbkę za pomocą 10 objętości buforu C T7 przy natężeniu przepływu 3 mililitrów na minutę. Dodaj glicerol, aby osiągnąć końcowe stężenie 10% i poddaj powstałą mieszaninę ultrafiltracji, aby uzyskać końcowe stężenie od trzech do czterech miligramów na mililitr.

Na początek należy zaopatrzyć się w roztwór fluorowanego lub lipidowego oleju mineralnego zawierający surfaktynę. Dodaj bezkomórkową syntezę białek lub mieszaninę CFPS do 500 mikrolitrów wcześniej przygotowanego oleju w 1,5 mililitrowej tubce i energicznie pocieraj probówkę o stojak na probówki 50 razy, aby utworzyć drobne kropelki. W celu przygotowania gigantycznego pęcherzyka jednowarstwowego lub GUV, dodaj 57 mikrolitrów chloroformu do czteromililitrowej szklanej fiolki, a następnie 18 mikrolitrów lipidów do końcowego stężenia ośmiu milimolów.

Odparować chloroform pod strumieniem argonu przez 15 minut, a następnie w próżni przez godzinę. Powstałe suche lipidy rozpuścić w 1 500 mikrolitrach oleju mineralnego, aby osiągnąć końcowe stężenie 400 mikromolowych. Aby uzyskać międzyfazową warstwę lipidową, powoli nałóż 250 mikrolitrów lipidowego roztworu oleju mineralnego na 500 mikrolitrów roztworu zewnętrznego pobranego w 1,5 mililitrowej probówce.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby utworzyć stabilną międzyfazową warstwę lipidową. Aby uzyskać roztwór wewnętrzny, dodaj polimerazę RNA T7, ekstrakt S30 i matrycę DNA do zimnego roztworu wstępnego. Wymieszaj 50 mikrolitrów roztworu wewnętrznego i 500 mikrolitrów lipidowego oleju mineralnego i energicznie wiruj.

Pozostaw probówkę na lodzie na 10 minut i powoli dodaj 20 mikrolitrów tej mieszaniny emulsji na wierzch wcześniej przygotowanej fazy olejowej w 1,5 mililitrowej tubce. Wirować przy około 800 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i obserwować tworzenie się GUV na dnie probówki. Po usunięciu górnej fazy olejowej ostrożnie odessaj 30 mikrolitrów GUV z dna rurki.

Dodaj siedem kropli kwasu siarkowego i dwie krople 50% nadtlenku wodoru do środka szkiełka nakrywkowego i inkubuj przez 45 minut. Po dokładnym spłukaniu ultraczystą wodą przyklej go do wyciętej 0,5 mililitrowej rurki mikrofuge. Utwardzać pod lampą ultrafioletową przez 10 minut, aby utworzyć komorę reakcyjną.

Następnie dodaj 75 mikrolitrów małego pęcherzyka jednowarstwowego lub zawiesiny SUV do wstępnie uformowanych komór reakcyjnych i inkubuj na bloku grzewczym w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną minutę. Następnie dodaj 150 mikrolitrów podpartej dwuwarstwy lipidowej lub buforu SLB A do komory reakcyjnej w celu dodatkowej dwuminutowej inkubacji. Przemyć komorę 200 mikrolitrami buforu B SLB przed wymianą buforu na bufor C S30, pozostawiając 100 mikrolitrów buforu wewnątrz komory, aby zapobiec wysychaniu podpartej dwuwarstwy lipidowej.

Za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej udało się uchwycić ekspresję białka zielonej fluorescencji i mCherry zamkniętych w kropelkach. Fluorescencyjny obraz kapsułkowanego CFPS w GUV wykazał ekspresję super folderowego zielonego białka fluorescencyjnego w znakowanej dwuwarstwie lipidowej.