Produkcja i wieloparametrowa mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji żywych komórek (FLIM) sferoid wielokomórkowych
9 sierpnia 2024
Tutaj opisujemy różne metody tworzenia wielokomórkowych sferoidów, aby przeprowadzić następczą wieloparametrową mikroskopię żywych komórek. Wykorzystując mikroskopię obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM), autofluorescencję komórkową, barwniki barwiące i nanocząstki, przedstawiono podejście do analizy metabolizmu komórkowego, niedotlenienia i śmierci komórki w żywych trójwymiarowych (3D) nowotworach i sferoidach pochodzących z komórek macierzystych.
W niniejszej pracy przedstawiamy i porównujemy metody tworzenia sferoidów, które można wykorzystać do analizy metabolizmu komórkowego i dystrybucji tlenu za pomocą mikroskopii żywych komórek. W ostatnich latach mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji była szeroko stosowana do badania biomarkerów metabolicznych, takich jak NADPH i FAD w żywych komórkach, a kilka fluorescencyjnych nanocząstek zostało opracowanych w celu zwielokrotnienia takich pomiarów z obrazowaniem natlenienia komórek i tkanek. Wielokomórkowe sferoidy, organoidy i narządy na chipie mogą replikować złożone, podobne do in vivo mikrośrodowisko, minimalizując potrzebę badań na zwierzętach.
W przypadku produkcji sferoidów pokazujemy różne metody formowania, mogą wahać się od niskiej do wysokiej przepustowości. Podkreślają również ich dostępność optyczną, kompatybilność z mikroskopem obrazowania fluorescencyjnego czasu życia oraz możliwość włączenia elementów macierzy zewnątrzkomórkowej. Tak więc, mimo że modele 3D in vitro zapewniają lepszy kontekst w porównaniu z hodowlami 2D, ich wysoka zmienność, niska odtwarzalność i niekompletna sprawozdawczość eksperymentalna pozostają problemem.
Parametry takie jak rozmiar sferoidy, skład składników odżywczych, lepkość zewnątrzkomórkowa, a nawet metody tworzenia sferoid mogą prowadzić do zwiększonej heterogeniczności komórkowej. Dzięki temu protokołowi dążymy do harmonizacji i standaryzacji metod produkcji sferoidów, podkreślając kluczowe aspekty ważne dla ciągłej i wieloparametrycznej analizy sferoid przy użyciu mikroskopii FLIM.
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono różne metody tworzenia wielokomórkowych sferoidów w celu analizy metabolizmu komórkowego i rozkładu tlenu przy użyciu mikroskopii żywych komórek. Badanie podkreśla zastosowanie mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM) do badania biomarkerów metabolicznych w żywych komórkach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Obrazowanie żywych komórek
Wstęp
- Wielokomórkowe sferoidy i organoidy odwzorowują mikrośrodowiska przypominające warunki in vivo.
- Mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji jest wykorzystywana do badania biomarkerów metabolicznych.
- Wysoka zmienność i niska powtarzalność stanowią wyzwania w przypadku trójwymiarowych modeli in vitro.
- W zależności od zastosowania można wykorzystać różne metody tworzenia sferoidów.
Cel badania
- Porównanie metod tworzenia sferoidów do mikroskopii żywych komórek.
- Analiza metabolizmu komórkowego, hipoksji i śmierci komórkowej w modelach 3D.
- Kształtowanie lepszego zrozumienia dystrybucji tlenu w systemach wielokomórkowych.
Zastosowane metody
- Mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM)
- Analiza autofluorescencji komórkowej
- Zastosowanie barwnikówstainujących i fluorescencyjnych nanocząstek
- Różne techniki tworzenia sferoidów
Główne wyniki
- Zaprezentowano metody analizy metabolizmu komórkowego w sferoidach 3D.
- Wykazano kompatybilność sferoidów z techniką FLIM w badaniach metabolicznych.
- Podkreślono znaczenie składników macierzy zewnątrzkomórkowej w formowaniu sferoidów.
- Omówiono problemy związane z powtarzalnością i zmiennością hodowli 3D.
Wnioski
- Różne metody tworzenia sferoidów mogą usprawnić analizę żywych komórek.
- Technika FLIM dostarcza cennych informacji na temat procesów metabolicznych w modelach 3D.
- Dalszy rozwój tych metod może zmniejszyć zależność od modeli zwierzęcych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ustandaryzowana produkcja oraz wieloparametrowa analiza FLIM sferoid wielokomórkowych rozwiązują kluczowe problemy w modelowaniu mikrośrodowisk nowotworowych na potrzeby poszukiwania nowych leków. Harmonizacja procesów tworzenia sferoid oraz obrazowania żywych komórek zwiększa wiarygodność prognostyczną odczytów metabolicznych i związanych z hipoksją, wspierając podejmowanie solidnych decyzji na wczesnych etapach badań. Podejście to wzmacnia ciągłość translacyjną i redukuje ryzyko biologiczne w portfelach B+R w obszarze onkologii i komórek macierzystych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie szlaków metabolicznych i gradientów tlenu w fizjologicznie istotnych modelach 3D.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez ilościowe określanie biomarkerów NADPH i FAD w żywych sferoidach.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki multipleksowym pomiarom metabolizmu i hipoksji.
- Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie angażowania celu i modulacji szlaków w złożonych systemach.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Umożliwia przygotowanie powtarzalnych trójwymiarowych modeli sferoid kompatybilnych z platformami FLIM w mikroskopii szerokopolowej, konfokalnej i dwufotonowej.
- Standaryzuje warunki analizy w celu zmniejszenia zmienności i zwiększenia wiarygodności wyników ilościowych.
- Umożliwia skalowalne, wysokoprzepustowe badanie wpływu związków na metabolizm i żywotność komórek.
- Wspiera rzetelną ocenę integracji biosensorów i nanosensorów dla odczytów multipleksowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zgodność profili metabolicznych i hipoksji in vitro z mikrośrodowiskiem guza istotnym dla przebiegu choroby.
- Zapewnienie ciągłości od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez ograniczenie zależności od modeli zwierzęcych.
- Umożliwienie podejmowania decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ilościowe dane multiparametryczne.
- Ułatwienie opracowania biomarkerów translacyjnych z wykorzystaniem wyników obrazowania FLIM w żywych komórkach.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten zharmonizowany schemat obejmuje cały proces od wczesnego etapu odkrywania, poprzez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną, wykorzystując standaryzowaną produkcję sferoidów oraz analitykę FLIM.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych w kontekstach 3D, naśladujących warunki in vivo.
- Przesiewy: Zapewnia powtarzalne, ilościowe odczyty metaboliczne i hipoksji w celu selekcji związków.
- Analityka: Umożliwia multipleksowe pomiary czasu życia fluorescencji dla wiarygodnego porównania warunków.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki in vitro z modelami przedklinicznymi poprzez odtworzenie cech mikrośrodowiska guza.
- Zastosowania korporacyjne: Tworzy platformę wielokrotnego użytku dla różnorodnych programów badawczo-rozwojowych w dziedzinie onkologii i komórek macierzystych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i ogranicza niejednoznaczność mechanistyczną w systemach modelowych 3D.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność procesów obrazowania żywych komórek.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz zwiększa efektywność kapitałową poprzez dostarczanie solidnych danych ilościowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydatów o potwierжденej istotności biologicznej.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w zakresie trójwymiarowych (3D) kultur komórkowych, mikroskopii żywych komórek oraz analizy FLIM.
- Wymaga dostępu do aparatury FLIM (mikroskopii szerokopolowej, konfokalnej lub dwufotonowej) oraz kompatybilnego oprogramowania analitycznego.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów wytwarzania sferoidów i obrazowania w ramach zespołów.
- Może wymagać adaptacji do różnych typów komórek, macierzy pozakomórkowych lub integracji czujników.
- Zmienność wielkości i składu sferoidów może wpływać na powtarzalność i interpretację danych.
FAQ Biopharma
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:51
High‐Throughput Generation of Multicellular Spheroids from Human Cancer Cell Line for Live 3D Imaging
4:15
Assessing the Impact of Spheroid Formation Methods in 3D Cell Culture Systems Using Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)
