Ocena aktywności naprawczej pęknięć podwójnej nici DNA przy użyciu wysokoprzepustowych i ilościowych testów reporterowych opartych na luminescencji
14 czerwca 2024
Prezentujemy protokoły oceny biegłości w naprawie szlaku pęknięć dwuniciowych w komórkach przy użyciu zestawu pozachromosomalnych substratów reporterowych opartych na luminescencji.
Artios opracowuje nowatorskie leki przeciwnowotworowe ukierunkowane na odpowiedź na uszkodzenie DNA. Aby to umożliwić, opracowaliśmy szereg nowatorskich testów do pomiaru aktywności naprawy DNA komórkowego. Testy te miały duży wpływ na nasze programy, prowadząc do testowania zasobów w fazie klinicznej u pacjentów z wysokimi niezaspokojonymi potrzebami medycznymi.
Dokładny pomiar aktywności komórkowej w miejscu docelowym ma zasadnicze znaczenie dla rozwoju nowych terapii celowanych. Generowanie testów dla czynników naprawy DNA o właściwościach wymaganych do napędzania skutecznej kampanii odkrywania leków było wyzwaniem, niezależnie od tego, czy chodzi o potrzebę wysokiej przepustowości, solidnego sygnału do szumu, szybkiej realizacji, a najlepiej możliwości przenoszenia do różnych systemów biologicznych. Opracowaliśmy zestaw solidnych ilościowych i miareczkowych testów reporterowych opartych na luminescencji, aby zmierzyć biegłość czterech głównych ścieżek naprawy pęknięć dwuniciowych, rekombinacji homologicznej, niehomologicznego łączenia końców, łączenia końcówek za pośrednictwem mikrohomologii i wyżarzania jednoniciowego.
Te testy reporterowe są walidowane jako odczytujące naprawę zależną od szlaku, są wrażliwe na modulację farmakologiczną i mają szybki czas realizacji. Opracowane przez nas substraty naprawcze są pozachromosomalne, dzięki czemu można je przejściowo transfekować do interesujących ich modeli i łatwo skalować do formatu o wysokiej przepustowości. Wierzymy, że nasze systemy testowe odgrywają ważną rolę w odkrywaniu leków DDR, ale także w pogłębianiu naszego zrozumienia biologii DDR.
W związku z tym mamy nadzieję, że metody te pomogą przyspieszyć identyfikację i ściganie nowych celów leków, co doprowadzi do powstania leków na choroby, takie jak rak, w przypadku których istnieje wiele niezaspokojonych potrzeb medycznych. Na początek wygeneruj każdy substrat reporterowy i sprawdź jego stężenie za pomocą spektrofotometru. Uzyskać 200 nanogramów substratu reporterowego.
Elektroforezę każdego substratu reporterowego wraz z drabinką DNA o wysokiej masie cząsteczkowej w 0,7% żelu TAE z agarozy zawierającym fluorescencyjne dwuniciowe barwienie DNA. Sprawdź, czy dla każdego podłoża reporterowego są obserwowane zdefiniowane pasma o odpowiednim rozmiarze. W przypadku oceny wpływu związków na test reporterowy, należy dozować związki rozpuszczone w nośniku do studzienek 96-dołkowej płytki.
Aby przygotować mieszankę transfekcyjną na 96-dołkową płytkę, rozcieńczyć plazmid kontrolny Firefly i dwuniciowy substrat reporterowy do naprawy pęknięć NanoLuc w 500 mikrolitrach buforu transfekcyjnego w 1,5-mililitrowej probówce. Po dodaniu odczynnika do transfekcji na bazie lipidów, mieszaninę DNA należy krótko zwirować i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Aby pobrać komórki, poddaj je trypsynizacji i ponownie zawieś w świeżej pożywce zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej lub FBS.
Następnie określ liczbę komórek i ponownie zawieś trzy razy 10 do mocy sześciu komórek w 8,5 mililitra podłoża z FBS w świeżej 15-mililitrowej probówce. Dodaj mieszankę transfekcji DNA do zawiesiny komórkowej i kilkakrotnie odwróć probówkę, aby wymieszać. Umieść 80 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na studzience i inkubuj 96-dołkową płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 24 godziny.
Przygotować kontrolną lucyferazy i odczynnik reporterowy lucyferazy zgodnie z instrukcjami producenta. Dodać substrat do odpowiedniej objętości buforu do oznaczania w stosunku 1:100 i wymieszać. Gdy płytka i odczynniki osiągną temperaturę pokojową, dodaj 80 mikrolitrów kontrolnego odczynnika lucyferazy świetlików na studzienkę.
Potrząsaj płytką przez trzy minuty na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 450 obrotów na minutę. Umieść płytkę w czytniku płytek luminescencyjnych i zmierz kontrolny sygnał luminescencji lucyferazy. Aby zmierzyć sygnał lucyferazy reporterowej, dodaj 80 mikrolitrów odczynnika reporterowego lucyferazy NanoLuc na studzienkę.
Po trzyminutowej inkubacji w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 450 obrotów na minutę, pozostaw płytkę do odpoczynku w temperaturze pokojowej na siedem minut. Na koniec zmierz sygnał luminescencji lucyferazy reporterowej w czytniku płytek luminescencyjnych. Ocena sygnału luminescencji komponentu NanoLuc i Firefly wykazała, że zaobserwowana wada naprawcza była spowodowana redukcją sygnału NanoLuc, podczas gdy sygnał sterujący Firefly był niezakłócony.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokoły oceny sprawności ścieżek naprawy pęknięć dwuniciowych w komórkach z wykorzystaniem luminescencyjnych substratów reporterowych pozachromosomalnych. Opracowane testy są kluczowe dla zrozumienia odpowiedzi na uszkodzenia DNA i ułatwiają proces odkrywania leków w onkologii.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Odpowiedź na uszkodzenia DNA
- Komórkowe mechanizmy naprawy
- Odkrywanie leków onkologicznych
Wstęp
- Pęknięcia obu nici DNA są krytycznymi uszkodzeniami, które wymagają efektywnej naprawy.
- Zrozumienie szlaków naprawczych jest niezbędne dla opracowywania ukierunkowanych terapii przeciwnowotworowych.
- Istniejące testy służące do pomiaru aktywności naprawy DNA wykazują ograniczenia w zakresie wydajności i czułości.
- Nowoczesne testy mogą usprawnić proces odkrywania leków poprzez dokładny pomiar aktywności komórkowej.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnych testów do pomiaru sprawności głównych szlaków naprawy pęknięć dwuniciowych.
- Ułatwienie identyfikacji nowych celów terapeutycznych w leczeniu nowotworów.
- Poprawa zrozumienia biologii odpowiedzi na uszkodzenia DNA.
Zastosowane metody
- Opracowanie testów reporterowych opartych na luminescencji dla czterech szlaków naprawy.
- Przejściowa transfekcja substratów pozachromosomalnych do modeli komórkowych.
- Pomiar sygnałów luminescencji w celu oceny wydajności naprawy.
- Walidacja testów pod kątem czułości na modulację farmakologiczną.
Główne wyniki
- Testy wykazały aktywność naprawczą zależną od szlaku.
- Pomiary ilościowe wykazały wrażliwość na modulację lekiem.
- Osiągnięto krótki czas oczekiwania na wyniki testów.
- Testy są skalowalne dla wysokoprzepustowych analiz przesiewowych.
Wnioski
- Opracowane testy stanowią wartościowe narzędzia w procesie odkrywania leków przeciwnowotworowych.
- Wspierają one zrozumienie mechanizmów naprawy DNA.
- Metody te mogą przyspieszyć identyfikację nowych celów terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe testy reporterowe oparte na luminescencji dla naprawy pęknięć dwuniciowych DNA umożliwiają wysokoprzepustowy, specyficzny dla danej ścieżki pomiar aktywności naprawy DNA w komórkach, bezpośrednio wspierając walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesie odkrywania leków onkologicznych. Testy te zapewniają szybkie, powtarzalne i skalowalne wyniki, które są niezbędne do rozwoju terapii ukierunkowanych na odpowiedź na uszkodzenia DNA (DDR). Ich integracja z procesami odkrywania leków zwiększa pewność predykcyjną i usprawnia selekcję projektów w portfolio aktywów celujących w DDR.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę aktywności szlaków DDR w celu funkcjonalnej walidacji celu.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez rozróżnienie sprawności naprawy specyficznej dla danego szlaku.
- Ułatwia uzyskanie pewności prognostycznej w zakresie angażowania celu i jego biologicznej istotności.
- Przyspiesza identyfikację i priorytetyzację nowych celów terapeutycznych w obrębie DDR.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane, ilościowe odczyty dla skutecznej standaryzacji testów.
- Oferuje wysokoprzepustowe, skalowalne formaty odpowiednie do przesiewowych badań związków.
- Gwarantuje powtarzalność i możliwość miareczkowania w różnych układach biologicznych.
- Umożliwia wiarygodną ocenę farmakologicznej modulacji szlaków naprawy DNA.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia zestawienie pomiarów naprawy specyficznej dla danej ścieżki z biologią DDR istotną dla przebiegu choroby.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkryć po przedkliniczną walidację celów DDR.
- Uzasadnia decyzje o rozwoju portfeli koncentrujących się na DDR, z uwzględnieniem analizy ryzyka.
- Dostarcza wglądu w mechanizmy, który pomaga w opracowaniu strategii dla biomarkerów translacyjnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Analizy te sytuują się w kontinuum procesu odkrywania leków, od wczesnej walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po przedkliniczną ocenę terapeutyków celujących w mechanizmy DDR.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków dla mechanizmów DDR.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość testu, powtarzalność i wyniki ilościowe do oceny związków.
- Analityka: Umożliwia czułe pomiary luminescencji w celu porównania aktywności naprawczej w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Pozwala na dopasowanie sprawności naprawy komórkowej do modeli chorób, gdy jest to właściwe.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje przenośną, skalowalną platformę możliwą do adaptacji w wielu systemach komórkowych i programach odkrywczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów DDR.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje i przyspiesza przepływy pracy w analizach dzięki skalowalności wysokoprzepustowej.
- Wartość strategiczna: Poprawia decyzje typu go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie uzyskania wiarygodnych wyników biologicznych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój aktywów celowanych w DDR.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu biologii molekularnej oraz projektowania testów luminescencyjnych.
- Konieczny jest dostęp do czytników płytek luminescencyjnych oraz standardowej infrastruktury do hodowli komórkowych.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności testów i porównywalności danych.
- Metoda jest adaptowalna do różnych modeli komórkowych poprzez przejściową transfekcję substratów pozachromosomalnych.
- Wyniki są zależne od zwalidowanych kontroli w celu odróżnienia aktywności naprawczej specyficznej dla danej ścieżki.
