Kwantyfikacja fenotypów oczu Drosophila melanogaster: podejście obliczeniowe integrujące ilastik i Flynotyper

Jesteśmy zainteresowani opracowaniem modeli chorób takich jak ALS, FTD i proteinopatia wieloukładowa, aby zrozumieć ich patologie molekularne. Jednym z modeli, których używamy, jest Drosophila Eye System. Regularność i symetryczny wzór oka można wykorzystać do oceny efektu wprowadzenia mutacji i zmian w ekspresji genów.

Nasz protokół wypełnia lukę w sposobach ilościowego określania szorstkich fenotypów oka. W szczególności luka powstała w wyniku ręcznego klasyfikowania. Ręczny ranking opiera się na fuzji, utracie Ommatidii i organizacji szczeciny.

Może to jednak prowadzić do stronniczości. Dlatego połączenie Ilastik i Flynotyper tworzy bardziej solidną metodę oceny nieprawidłowych fenotypów oczu. Nasz protokół może być korzystny dla ręcznego rankingu ze względu na swoją solidność.

Nawet nieprzeszkoleni członkowie laboratorium mogą przeprowadzić udaną kwantyfikację, podczas gdy bardziej wyszkolony badacz jest prawdopodobnie potrzebny do ręcznego klasyfikowania, aby uniknąć różnic między wynikami między dwoma różnymi badaczami. Dlatego ten protokół może zaoszczędzić czas i zasoby. Nasze odkrycia naprzód badania, ponieważ protokół ten pozwala na dokładniejszą kwantyfikację szorstkich fenotypów oka, zwłaszcza słabych zmian w morfologii oka.

Ze względu na stronniczość głównie w rankingu, znalezienie Ilastik i Flynotyper doprowadzi do dokładniejszej punktacji, a tym samym zaowocuje dokładniejszymi wynikami opublikowanych książek. Aby rozpocząć, umieść obrazy zdrowych i zdegenerowanych oczu muchy Drosophila w tym samym folderze, upewnij się, że pliki są odpowiednio nazwane, aby zidentyfikować grupy eksperymentalne i rozróżnić samce i samice. Otwórz oprogramowanie Ilastik.

Kliknij utwórz nowy projekt. Następnie z innych przepływów pracy wybierz inwentaryzację gęstości komórek i wybierz lokalizację, w której chcesz zapisać plik projektu. Kolejno klikaj na jedne dane wejściowe, dodaj nowe i dodaj osobne obrazy, aby wybrać obraz standardowy.

Następnie kliknij na dwie opcje wyboru funkcji i wybierz funkcje. Wybierz więcej wartości sigma, aby zwiększyć czułość, kliknij trzy zliczanie i ustaw wartość sigma na pierwszym planie na 5.00. Korzystając z narzędzia pierwszego planu, zaznacz 50 lub więcej pojedynczych Ommatidium na standardowym obrazie.

Kliknij ponownie liczenie trzech i użyj narzędzia tła, aby zaznaczyć obszar poza Ommatidia. Narysuj zielone linie w kształcie kraty wokół Ommatidii. Kliknij cztery ustawienia eksportu obrazu i wybierz ustawienia eksportu obrazu, aby dostosować ustawienia obrazu.

Następnie kliknij informacje o pliku wyjściowym i wybierz format tiff do dalszej analizy w Flynotyper, kliknij pięć procesów przetwarzania wsadowego. Wybierz pliki z surowymi danymi i wybierz wszystkie eksperymentalne zdjęcia much, które mają zostać przeanalizowane. Lista zaimportowanych obrazów do analizy jest widoczna w wybranych plikach danych raw.

Kliknij opcję Przetwarzaj wszystkie pliki u dołu sekcji przetwarzania pięciu wsadów. Po zakończeniu przetwarzania przez oprogramowanie sprawdź folder zawierający eksperymentalne obrazy lotu ptaka. Upewnij się, że istnieją czarne obrazy o nazwie prawdopodobieństwa nazwy próbki.

Na obrazie J otwórz plik Ilastik generated. tiff. Użyj narzędzia do zaznaczania prostokąta, aby utworzyć prostokąt wokół oka.

Naciśnij ctrl plus X lub ctrl plus C, aby przyciąć obszar i poczekaj, aż pojawi się ramka w kształcie konturu prostokąta. Kolejno kliknij plik, nowy i wewnętrzny schowek, aby otworzyć przycięte oko muchy. Aby zapisać wycięte oko muchy jako JPEG, kliknij plik, zapisz jako i JPEG Na obrazie J kliknij wtyczki i Flynotyper.

W obszarze genotypy wybierz dodaj genotypy i otwórz folder zawierający obrazy wyciętych oczu muchy. Zaznacz pola mikroskopu świetlnego i pionowo. Następnie pod rangą Ommatidia według'sprawdź stabilność i odległość do środkowych pól.

Dla liczby uszeregowanych Ommatidia przyjęto dane wejściowe zestawu jako 200. Kliknij przycisk Uruchom i poczekaj na wyświetlenie wyników analizy. Skopiuj i wklej przykładowy plik i wynik P do oprogramowania statystycznego w celu dalszej analizy.

Obrazy oczu Drosophila przetworzone za pomocą Ilastik i analizowane w świetle pierścieniowym wykazały wyraźne wzorce ommatidialne w porównaniu z tymi bez światła pierścieniowego, co poprawiło ocenę jakościową. Analiza Flynotyper wykazała istotnie wyższe wyniki fenotypowe w umiarkowanie i poważnie zdegenerowanych oczach muchy w porównaniu z oczami bez zwyrodnienia. Gdy Ilastik nie był stosowany, wyniki P między oczami niezdegenerowanymi i umiarkowanie zwyrodniałymi były podobne.