Optymalizacja przygotowania próbek do kriogenicznej mikroskopii elektronowej
11 kwietnia 2025
Ten protokół przedstawia praktyczną metodę wykorzystującą Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) jako przykład rozwiązania problemu nierównomiernego rozkładu cząstek poprzez optymalizację przygotowania próbki, stanowiąc punkt odniesienia dla badaczy do efektywnego wyjaśniania struktur makromolekularnych za pomocą kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryo-EM).
Przygotowanie próbek kriogenicznych wiąże się z wyzwaniami, które mogą ograniczyć ich skuteczność, w szczególności z nierównomiernym rozkładem cząstek. Problem ten często prowadzi do słabej rozdzielczości i zmniejszonej dokładności w nowo konstruowanych strukturach białkowych. W celu przezwyciężenia nierównomiernego rozkładu cząstek stosuje się różne podejścia eksperymentalne, w tym dodawanie detergentów lub naśladowców membran do próbki, modyfikację folii nośnej siatki i przechylanie określonego etapu podczas zbierania danych.
Protokół ten analizuje prostą, praktyczną metodę rozwiązywania problemów związanych z nierównomiernym rozkładem cząstek poprzez optymalizację przygotowania próbek, zapewniając naszym odniesieniem dla naukowców do skutecznego zilustrowania struktur makromolekuł za pomocą kriogenu. Aby rozpocząć, zbierz zbiorcze frakcje białkowe zawierające małe białko szoku cieplnego MJ 16.5. Użyj filtrów odśrodkowych z granicą masy cząsteczkowej 50 kilodaltonów, aby skoncentrować frakcje w temperaturze czterech stopni Celsjusza do około 65 miligramów.
Po zagęszczeniu odwirować próbkę o stężeniu 16 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu usunięcia kruszyw. Podzielić 50 mikrolitrów objętości supernatantu na 0,2 mililitra cienkościennych probówek PCR. W przypadku transmisyjnej mikroskopii elektronowej rozmrozić dwie zamrożone probówki białkowe na lodzie.
Po rozmrożeniu przesuń rurkę kilka razy, aby wymieszać. Następnie odwirować roztwór białka o stężeniu 16 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu usunięcia agregatów. Następnie wstrzyknąć supernatant do kolumny chromatograficznej wykluczającej wielkość i zebrać 0,5 mililitra frakcji elucyjnej.
Zbierz frakcje elucjańskie odpowiadające pikowi, wykazujące najwyższą absorbancję ultrafioletu przy 280 nanometrach. W celu wymiany buforu za pomocą nożyczek pokrój membranę dializacyjną na kawałki o wymiarach 30 na 30 milimetrów. Inkubować kawałki w wodzie destylowanej lub roztworach buforowych, aby je zrównoważyć.
Następnie dodaj 55 mikrolitrów roztworu białkowego do komory z przyciskami do mikrodializy o pojemności 50 mikrolitrów. Trzymaj membranę dializacyjną pionowo za pomocą kleszczy i delikatnie dotknij jedną krawędzią membrany o bibułę, aby odsączyć nadmiar płynu. Ostrożnie przykryj przycisk do mikrodializy membraną.
Umieść pierścień uszczelniający o przekroju okrągłym na membranie dializacyjnej i delikatnie zwiń go w rowek na krawędzi przycisku. Zanurzyć każdy przycisk dializy w oddzielnej zlewce zawierającej bufor docelowy, stroną z membraną skierowaną do góry. Za pomocą strzykawki z cienką igłą ostrożnie przebić membranę i odzyskać roztwór białka z komory do mikrodializy.
Załaduj pięć mikrolitrów próbki o stężeniu od 20 do 120 nanogramów na mililitr na siatkę rozżarzenia. Przygotuj trzy krople wody po 50 mikrolitrów każda na arkuszu folii parafinowej. Pocieraj powierzchnię siatki o krople wody, aby umyć próbkę.
Teraz załaduj pięć mikrolitrów przefiltrowanego 1% roztworu octanu pisuaru na siatkę i natychmiast odpipetuj roztwór octanu pisuaru. Załaduj kolejne pięć mikrolitrów roztworu octanu pisuaru na siatkę. Delikatnie dotknij strony pęsety siatki bibułą filtracyjną, aby usunąć nadmiar roztworu barwiącego i pozostaw siatkę do wyschnięcia.
Zamontuj pęsetę i zespół siatki wyładowczej jarzeniowej na instrumencie. Następnie załaduj cztery mikrolitry próbki na węglową stronę siatki. Zainicjuj proces zamrażania wgłębnego.
Aby przygotować siatki do załadowania do transmisyjnego mikroskopu elektronowego lub TEM, najpierw umieść skrzynkę siatkową zawierającą zeszklone siatki w stacji montażu automatycznej siatki i odkręć pokrywę pudełka siatkowego zawierającego zeszklone siatki. Umieść pierścień automatycznej siatki w wyznaczonym miejscu do wycięcia na stanowisku montażowym. Ostrożnie przenieś zeszkloną siatkę z pudełka z siatką i umieść ją w pierścieniu automatycznej siatki.
Teraz wyrównaj dysk, aby ustawić okrągły otwór na górze pierścienia automatycznej siatki i zespołu siatki. Aby przymocować siatkę do pierścienia automatycznej siatki, umieść narzędzie do wkładania zacisku C na górze siatki i delikatnie dociśnij, aby zabezpieczyć zacisk C w środku. Obróć dysk z powrotem i przenieś zmontowane siatki do schowka z automatyczną siatką.
Zmontuj kasetową stację ładowania i schłodź ją ciekłym azotem. Umieść skrzynkę magazynową z automatyczną siatką w stacji załadowczej. Przenieś zespół siatki ze skrzynki do przechowywania automatycznej siatki do kasety.
Użyj uchwytu, aby umieścić kasetę w kapsule automatycznego podajnika. Sprawdź pin w automatycznej ładowarce, aby potwierdzić jego swobodny ruch i upewnić się, że nie jest zamrożony. Akumulację cząstek w układach obserwowano na wszystkich badanych siatkach, niezależnie od warunków buforowych czy modyfikacji ładunku powierzchniowego.
Wyższe stężenie białka w połączeniu z ujemnie naładowanymi siatkami w dziewięciu milimolach mobstress, 50 milimolach chlorku sodu i 0,1 milimola buforu EDTA spowodowało pożądany rozkład pojedynczych cząstek w otworach siatki, zmniejszając tworzenie się macierzy białkowej. Ten zoptymalizowany warunek doprowadził do uzyskania wysokiej wartości współczynnika powierzchni stożkowej FSC wynoszącej 0,80 i wartości SCF wynoszącej 0,859, co potwierdza równomierny rozkład cząstek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia praktyczną metodę rozwiązania problemu nierównomiernego rozkładu cząstek podczas przygotowywania próbek do kriomikroskopii elektronowej (cryo-EM), posługując się przykładem białka z Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5). Stanowi on punkt odniesienia dla badaczy dążących do efektywnego wyjaśnienia struktur makromolekularnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Kriomikroskopia elektronowa
- Optymalizacja przygotowania próbek
- Analiza struktur makromolekularnych
Wprowadzenie
- Przygotowywanie próbek do krio-mikroskopii elektronowej wiąże się z wyzwaniami, takimi jak nierównomierny rozkład cząsteczek.
- Problem ten może prowadzić do niskiej rozdzielczości oraz błędów w konstruowanych strukturach białek.
- Istnieje wiele podejść eksperymentalnych mających na celu ograniczenie nierównomiernego rozkładu cząsteczek.
- Powszechnie stosowanymi strategiami są detergenty, imitatory błon oraz modyfikacje podłoża siatek.
Cel badania
- Analiza praktycznej metody optymalizacji przygotowania próbek.
- Przedstawienie punktu odniesienia dla badaczy zajmujących się krio-EM.
- Skuteczna ilustracja struktur makromolekularnych.
Zastosowane metody
- Zebrać połączone frakcje białek zawierające małe białko szoku cieplnego 16,5 z MJ.
- Użyć filtrów odwirujących o ograniczeniu masy cząsteczkowej (MWCO) wynoszącym 50 kilodalton.
- Skoncentrować frakcje w temperaturze czterech stopni Celsjusza do około 65 miligramów.
- Zastosować różne podejścia eksperymentalne w celu poprawy rozkładu cząstek.
Główne wyniki
- Protokół skutecznie rozwiązuje problem nierównomiernego rozmieszczenia cząsteczek.
- Ulepszone przygotowanie próbek prowadzi do lepszej rozdzielczości w cryo-EM.
- Zapewnia naukowcom niezawodną metodę analizy struktur makromolekularnych.
- Wykazuje znaczenie optymalizacji próbek w technikach kriogenicznych.
Wnioski
- Optymalizacja przygotowania próbek jest kluczowa dla skutecznej krio-EM.
- Przedstawiona metoda stanowi wartościowy punkt odniesienia dla badaczy.
- Rozwiązanie problemu nierównomiernego rozkładu cząstek usprawnia wyjaśnianie struktury.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Optymalizacja przygotowania próbek do krio-EM bezpośrednio wpływa na wiarygodność wysokorozdzielczego wyznaczania struktur makromolekularnych, co stanowi krytyczny punkt zwrotny we wczesnych etapach odkrywania leków i walidacji celów terapeutycznych. Rozwiązanie problemu nierównomiernego rozkładu cząsteczek zwiększa pewność prognostyczną danych strukturalnych, wspierając późniejsze badania przesiewowe i ograniczanie ryzyka mechanistycznego. Udoskonaleń tego przepływu pracy są niezwykle istotne dla zespołów biofarmaceutycznych dążących do uzyskania solidnych i powtarzalnych informacji strukturalnych, które posłużą do podejmowania decyzji dotyczących portfela projektów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia dokładną wizualizację konformacji białek w celu funkcjonalnej walidacji celu.
- Zmniejsza niejednoznaczność strukturalną, wspierając ograniczanie ryzyka mechanistycznego przy wyborze celu.
- Zwiększa pewność w testowaniu hipotez opartych na strukturze oraz w analizie szlaków sygnałowych.
Przesiewy i opracowanie testów
- Ułatwia przygotowanie jednorodnych próbek dla powtarzalnych analiz cryo-EM.
- Wspiera standaryzację przygotowania siatek, zwiększając skalowalność i niezawodność analizy.
- Umożliwia ilościową ocenę rozkładu cząstek, co jest kluczowe dla oceny gotowości do screeningu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia ciągłość strukturalną od etapu odkrywania do walidacji przedklinicznej podczas badania istotnych dla danej choroby celów terapeutycznych.
- Poprawia postępy w procesie dostosowanym do ryzyka poprzez zapewnienie jakości danych strukturalnych niezbędnych do wyboru kandydatów.
- Wspiera dopasowanie wyników strukturalnych do translacyjnych strategii biomarkerów, jeśli jest to właściwe.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Ta optymalizacja przygotowania próbek znajduje zastosowanie na styku wczesnej fazy odkrywania i identyfikacji wiodących związków, zapewniając integralność danych strukturalnych przed późniejszym screeningiem i modelowaniem przedklinicznym.
- Biologia odkrywcza: Usprawnia weryfikację hipotez poprzez minimalizację artefaktów wynikających z nierównomiernego rozkładu cząstek.
- Screening: Pozwala na uzyskanie powtarzalnych, wysokiej jakości siatek niezbędnych do wiarygodnej oceny związków.
- Analityka: Dostarcza ilościowych mierników (np. stosunek powierzchni FSC, wartość SCF) służących do oceny jakości próbek.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość analiz strukturalnych w ramach przedklinicznych przepływów pracy, gdy jest to zasadne.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia zstandaryzowany, skalowalny protokół do wielokrotnego stosowania w różnych celach i programach badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach strukturalnych.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację przygotowania próbek do cryo-EM.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie lepszych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) dzięki zapewnieniu wysokiej jakości danych strukturalnych na wczesnym etapie procesu.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój celów zwalidowanych strukturalnie.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie oczyszczania białek, przygotowywania siatek oraz obsługi aparatury do cryo-EM.
- Niezbędny jest dostęp do wysokiej jakości filtrów odśrodkowych, aparatury do chromatografii oraz sprzętu do witryfikacji.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów postępowania z próbkami i przygotowywania siatek pomiędzy zespołami.
- Może być wymagana adaptacja metody dla różnych klas białek lub warunków buforowych.
- Skuteczność zależy od dokładnej kontroli stężenia białka oraz właściwości powierzchni siatki.
