Posiew glejowy jelitowy koni i zastosowanie do badania neuronalnego mechanizmu zapalnego w kolce koni

Konie borykają się z wyniszczającymi stanami zapalnymi pooperacyjnymi po operacji kolki, W badaniach na ludziach komórki glejowe jelitowe zyskują sławę jako kluczowe czujniki środowiska jelitowego, a także czynniki wpływające na stan zapalny. Naszym celem było wyizolowanie komórek glejowych jelitowych z jelita cienkiego koni, aby ocenić ich rolę w zrozumieniu i zapobieganiu powikłaniom pooperacyjnym. Opracowaliśmy powtarzalny protokół izolowania podśluzówkowych komórek glejowych jelitowych z jelita koni.

Udało nam się również zademonstrować jego zastosowanie w zrozumieniu wpływu zapalnego gleju jelitowego na funkcję bariery jelitowej, co może mieć ważne implikacje dla przyszłych badań nad kolkami, powikłaniami pooperacyjnymi i chorobami jelit. Nasze laboratorium będzie nadal koncentrować się na związku gleju jelitowego w zapalnym środowisku jelitowym, a także na tym, w jaki sposób zapobieganie utracie funkcji barierowej przez przeciwzapalne leki biologiczne może być stosowane w celu zapobiegania powikłaniom pooperacyjnym. Na początek pokryj 24-dołkowe płytki roztworem powlekającym i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza lub przez noc w temperaturze pokojowej.

Umyj płytki dwa razy sterylną wodą i przechowuj je w temperaturze pokojowej, aż komórki będą gotowe do posiewu. Teraz weź fragment jelita czczego konia i umieść go w zimnym roztworze Ringera na lodzie. Usuń 10-centymetrową część z jelita czczego i otwórz ją na granicy antykrezkowej, umieszczając obszary nielimfoidalne pośrodku.

Następnie przytnij porcję na odcinek o wymiarach około siedem na siedem centymetrów i dobrze spłucz tkankę w świeżym roztworze Ringera przed preparacją. Teraz przypnij tkankę do płytki Petriego pokrytej elastomerem silikonowym w zimnym roztworze Ringera lub PBS śluzówką do góry, rozciągając ją tak bardzo, jak to możliwe. Za pomocą zakrzywionych kleszczy usuń kosmki jelitowe, a następnie usuń warstwę blaszki właściwej z około pięciu na pięć centymetrów obszaru nielimfatycznego.

Następnie za pomocą nożyczek do mikrodysekcji usuń błonę podśluzową w jednym arkuszu, uwalniając ją w jednym rogu. Obserwuj naturalną separację podczas odrywania błony podśluzowej od wewnętrznej warstwy mięśni okrężnych. Następnie zmiel zebraną warstwę podśluzówkową na dwa do pięciu milimetrowych kawałków.

Umieść je w 50-mililitrowej stożkowej tubie zawierającej pięć mililitrów Organo bez FBS, kolagenazy, proteazy i BSA. Inkubuj tkankę przez dwie do trzech godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu trawienia enzymatycznego. Po inkubacji dodaj 10 mililitrów Organo o temperaturze pokojowej z FBS, aby zatrzymać działanie enzymu.

Pipetować mieszaninę tkanek w górę iw dół 15 razy za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej, aby oddzielić komórki od tkanki. Następnie odwirować mieszaninę o stężeniu 3 000 G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Następnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach PBS o temperaturze pokojowej, pipetując roztwór w górę iw dół 15 razy za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej.

Odwirować stożkową probówkę o stężeniu 3 000 G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Po odrzuceniu supernatantu, ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach Organo o temperaturze pokojowej z FBS, pipetując w górę i w dół 15 razy. Następnie przefiltruj komórki sekwencyjnie przez sitko o wielkości porów 100 mikrometrów, 70 mikrometrów i 40 mikrometrów.

Po odwirowaniu komórek i odrzuceniu supernatantu, ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze Organo z FBS. Następnie wybarwić komórki błękitem trypanowym, aby zidentyfikować żywe komórki i policzyć je za pomocą hemocytometru. Teraz wysiew około 400 000 komórek w 300 mikrolitrach Organo z FBS w każdym dołku 24-dołkowej płytki.

Dodaj pięć mikrolitrów N2, pięć mikrolitrów G5 i 10 mikrolitrów B27 do każdej studzienki. Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, aby umożliwić adhezję komórek. Gdy komórki z pierwszego przejścia osiągną 70 do 80% konfluencji, wystaw studzienki na działanie 0, 10 i 25 nanogramów interleukiny-1 beta przez 24 godziny.

W hodowlach zaobserwowano komórki wrzecionowate zgodne z morfologią gleju jelitowego, z pleomorfizmem i minimalnym zanieczyszczeniem innymi typami komórek. Na początek pokryj wkładki Transwell 42 mikrolitrami 0,05% Matrigelu. Inkubować przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby Matrigel stężał.

Zassać dodatkowe podłoże i suszyć Transwells przez 30 minut bez przykrycia. Następnie dodaj 200 mikrolitrów pożywki DMEM F12 do każdej wkładki i przechowuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza do momentu użycia. Umyj paszteciki Matrigel zawierające organoidy PBS.

Wystaw je na 500 mikrolitrów odzyskiwania komórek na lodzie i wielokrotnie pipetuj mieszaninę, aby zapewnić pełne zebranie komórek w 15-mililitrowej probówce. Następnie odwirować probówkę o stężeniu 300 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w docelowej objętości komórek macierzystych nabłonka jelitowego lub pożywki IESC.

Teraz wstępnie pokryj jednomililitrową strzykawkę w podłożu IESC. Odessać zawiesinę komórek przez igłę o rozmiarze 16. Następnie zastąp igłę o rozmiarze 16 igłą o rozmiarze 28 i wyrzuć zawiesinę, aby ułatwić oddzielenie organoidów.

Następnie umieść 200 mikrolitrów powstałej zawiesiny komórek w wierzchołkowej stronie powlekanych Transwells. Dodaj 500 mikrolitrów pożywki IESC i czynników wzrostu po stronie podstawowej. Użyj dwuelektrodowej komory pomiarowej TEER, aby określić ilościowo TEER w monowarstwach.

Napełnij kubek hodowlany 1.5 mililitra pożywki IESC i upewnij się, że we wkładce Transwell znajduje się dokładnie 200 mikrolitrów pożywki, aby poziomy płynów zgadzały się podczas pomiaru. Wystaw podstawno-boczny aspekt wkładek Transwell na cytokiny zapalne interleukiny-1 beta lub produkty glejowe z kultur narażonych na interleukinę-1 beta. Mierz TEER co 10 do 15 minut przez 45 minut, umieszczając każdy Transwell w kubku hodowlanym.

Podstawno-boczna ekspozycja na pożywki z kultur glejowych traktowanych 10 i 25 nanogramami interleukiny-1 beta znacznie zwiększyła przepuszczalność bariery nabłonkowej. Nie zaobserwowano istotnego wzrostu przepuszczalności nabłonka po ekspozycji na interleukinę-6 koni w różnych stężeniach.