Obrazowanie pojedynczych cząsteczek FRET do obserwacji dynamiki konformacyjnej atlastyny GTPazy podobnej do dynaminy
24 stycznia 2025
Funkcje białek nadrodziny dynamin zależą od zmian konformacyjnych sprzężonych z hydrolizą GTP. System opisano za pomocą techniki jednocząsteczkowego FRET (smFRET) do monitorowania dynamiki konformacyjnej atlastyny GTPazy podobnej do dynaminy w różnych stanach obciążenia nukleotydami.
Jesteśmy zaangażowani w badanie mechanizmu fuzji błon wewnątrzkomórkowych. W tym protokole dążymy do uświadomienia sobie dynamiki konformacyjnej białka fuzyjnego błony retikulum endoplazmatycznego atlastyny podczas cyklu hydrolizy GTP za pomocą smFRET. Atlastyna może występować jako monomer lub dimer w cyklu hydrolizy GTP.
W eksperymentach z pojedynczymi cząsteczkami trudno jest znaleźć odpowiednie strategie znakowania i immobilizacji białek, a poniżej przedstawiono dynamikę konformacyjną atlastyny w całym cyklu hydrolizy GTP. W porównaniu z masowym FRET, smFRET może dokładnie monitorować konformacje białek w różnych stanach obciążenia nukleotydami, zapewniając w ten sposób bezpośredni wgląd w zachowanie cząsteczek modulatora. Użyliśmy smFRET, aby w pełni rozwiązać cykl hydrolizy GTP atlastyny podczas różnych strategii pozycji.
Wierzymy, że nasze odkrycia przyczynią się do zwiększenia dynamiki konformacyjnej w badaniu białek hydrolizy GTP i dostarczą nowych interpretacji rzadkich procesów biologicznych. Aby oczyścić powierzchnię szkiełka nakrywkowego, użyj pęsety, aby zebrać osiem szkiełek nakrywkowych i umieść je w słoiku do barwienia. Dodaj 50 mililitrów acetonu, aby przykryć szkiełka nakrywkowe i umieść słoik do barwienia w myjce ultradźwiękowej na 30 minut.
Szkiełka nakrywkowe należy trzykrotnie spłukać wodą podwójnie destylowaną i umyć metanolem w myjce ultradźwiękowej. Następnie dodaj roztwór piranii do słoika do barwienia i podgrzewaj go w czajniku do kąpieli wodnej w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Po schłodzeniu słoika do temperatury pokojowej spłucz szkiełka nakrywkowe sześć razy wodą podwójnie destylowaną.
Dodaj roztwór mettlenku sodu do słoika do barwienia i umieść go w myjce ultradźwiękowej na 15 minut. Po spłukaniu szkiełek nakrywkowych wodą, dodaj podwójnie destylowaną wodę do słoika do barwienia i umieść ją w myjce ultradźwiękowej na 15 minut. Zacisnąć szkiełka nakrywkowe w słoiku do barwienia i osuszyć je azotem.
Przełóż wysuszone szkiełka nakrywkowe do innego słoika do barwienia i piecz słoik w suszarce w temperaturze 120 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie schłodzić słoik do temperatury pokojowej w eksykatorze. Dodaj 47,5 mililitra metanolu, 2,5 mililitra kwasu octowego i 0,5 mililitra trietoksysilanu do zlewki i równomiernie wymieszaj.
Przenieś mieszaninę do słoika do barwienia i inkubuj przez 10 minut. Spłucz szkiełka nakrywkowe trzykrotnie podwójnie destylowaną wodą w słoiku do barwienia i sonikuj przez pięć minut. Po spłukaniu szkiełek nakrywkowych wodą i wysuszeniu ich azotem, jak pokazano, umieść szkiełka nakrywkowe na szalce Petriego o średnicy 10 centymetrów.
Rozpuścić SVA-mPEG i SVA-mPEG-Biotyna w roztworze o wysokiej zawartości soli w stosunku 1:100. Upuść przygotowaną mieszankę na szkiełko nakrywkowe i przykryj je innym szkiełkiem nakrywkowym. Inkubować szkiełka nakrywkowe w odpowiedniej wilgotności przez dwie godziny lub przez noc.
Po modyfikacji oddziel szkiełka nakrywkowe, spłucz je wodą dejonizowaną i wysusz suszarką azotem. Ostrożnie umieść zmodyfikowane szkiełko nakrywkowe w 50-mililitrowej tubce. Po oczyszczeniu domeny GTPazy białka dynaminopodobnego atlastyny lub ATL ulegającego ekspresji w komórkach Rosetta E. coli, zmień bufor białkowy na bufor biotynylacji białek za pomocą 10-kilodaltonowego filtra odśrodkowego.
W przypadku biotynylacji białek wymieszaj po 100 mikrolitrów 100-milimolowego ATP, 100-milimolowego octanu magnezu i 500-mikromolowej D-biotyny, 10 mikrolitrów 100-mikromolowej ligazy biotyny BirA i 50-mikromolowej białka do końcowej objętości jednego mililitra. Inkubuj mieszaninę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia usuń wolną D-biotynę za pomocą 10-kilodaltonowego filtra odśrodkowego o masie cząsteczkowej.
Inkubować 20 mikrolitrów biotynylowanego białka z 20 mikrolitrami 15-mikromolowej streptawidyny przez 20 minut na lodzie. Wykryj skuteczność biotynylacji białek za pomocą SDS-PAGE. Rozpuść fluorofory LD555 i LD655 w dimetylosulfotlenku do końcowego stężenia pięciu milimolów.
Aby przygotować bufor do etykietowania, wymieszaj 25 milimolowych HEPES, 150 milimolowych chlorków potasu i pięć milimolowych chlorków magnezu. Zmień bufor białkowy na bufor znakujący za pomocą 10-kilodaltonowego filtra odśrodkowego. W przypadku wewnątrzcząsteczkowych testów smFRET należy zmieszać ATL1cyto-TK z LD555 i LD655 w stosunku 1:1,2:1,2 do końcowej objętości 100 mikrolitrów.
Inkubuj mieszaninę przez pięć godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W przypadku międzycząsteczkowych testów smFRET inkubować ATL1cyto-K z LD555 i biotynylowany ATL1cyto-K z LD655 przez pięć godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby przygotować komorę do immobilizacji białek, ostrożnie przyklej zmodyfikowane szkiełko nakrywkowe i szkiełko mikroskopowe za pomocą dostosowanej taśmy dwustronnej.
Zainstaluj węże i końcówki, aby utworzyć komorę mikroprzepływową z sześcioma kanałami. W celu naniesienia poprawek mapowych dodaj 10 mikrolitrów 10% cząstek polistyrenu na szkiełko mikroskopowe i przykryj je szkiełkiem nakrywkowym. Następnie, pod mikroskopem fluorescencyjnym z całkowitym wewnętrznym odbiciem, wybierz pole view zawierające cząstki polistyrenu i nagraj wideo w trybie jasnego pola.
Użyj niestandardowego skryptu, aby wyrównać środkowe położenie tej samej cząstki polistyrenu zarówno w kanale dawcy, jak i akceptora. Zapisz plik mapy jako plik TXT. W przypadku międzycząsteczkowych eksperymentów smFRET zmieszaj LD555 znakowaną ATL1cyto-K z LD655 znakowaną ATL1cyto-K-biotyną w stosunku jeden do jednego o końcowym stężeniu jednego milimola GTP-gamma-S.
Inkubuj mieszaninę na lodzie przez godzinę, aby dimeryzować białka. Wymieszaj LD555 znakowaną ATL1cyto-T z LD655 znakowaną ATL1cyto-K-biotyną w stosunku jeden do jednego z jednym milimolem GTP-gamma-S do międzycząsteczkowych eksperymentów smFRET ATL1cyto-T i ATL1cyto-K. Inkubować mieszaninę na lodzie przez godzinę, aby uzyskać dimeryzowane białka.
Następnie, w przypadku wewnątrzcząsteczkowych testów smFRET, inkubować LD555 i LD655 znakowane ATL1cyto-TK z jednym milimolem GDP na lodzie przez jedną godzinę. W przypadku eksperymentów międzycząsteczkowych inkubować 10 mikrogramów na mililitr streptawidyny przez 10 minut, aby unieruchomić białka. W przypadku testów wewnątrzcząsteczkowych dodaj 10 mikrogramów na mililitr biotynylowanego przeciwciała anty-He i inkubuj przez 10 minut w celu unieruchomienia białek.
Po inkubacji dodaj rozcieńczony dimer ATL1 do białka w kanale i pozwól mu unieruchomić się przez 10 minut. Przepłukać kanał dwukrotnie buforem inkubacyjnym. Dodaj kwas benzoesowy i PCD do kanału w końcowym stężeniu 2,5 milimola.
Wybierz laser o długości fali 532 nm jako źródło światła wzbudzenia. Ustaw kamerę EMCCD tak, aby rejestrowała dane w odstępie między klatkami wynoszącym 30 milisekund. Zapisz nagrane filmy w 16-bitowym formacie TIFF.
Po pozyskaniu danych wyodrębnij ścieżki FRET z nagranych filmów. Wybierz i zapisz ścieżki FRET w formacie TXT. Wyodrębnij dane z plików TXT i oblicz wartości FRET za pomocą domowych skryptów w MATLAB.
Dopasuj dane smFRET według GaussAmp w Origin, aby uzyskać histogram rozkładu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje dynamikę konformacyjną białka fuzji błony siateczki śródplazmatycznej, atlastyny, podczas cyklu hydrolizy GTP z wykorzystaniem FRET pojedynczych cząsteczek (smFRET). Praca ta zwraca uwagę na trudności związane ze strategiami znakowania i immobilizacji białek w eksperymentach na pojedynczych cząsteczkach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Biofizyka
Wstęp
- Białka z superrodziny dynaminy są kluczowe dla fuzji błon.
- Atlastyna może występować w formie monomerów lub dimerów podczas hydrolizy GTP.
- Jednocząsteczkowy FRET dostarcza informacji o konformacjach białek.
- Zrozumienie dynamiki atlastyny jest niezbędne do wyjaśnienia mechanizmów fuzji błon.
Cel badania
- Zbadanie zmian konformacyjnych atlastyny podczas hydrolizy GTP.
- Wykorzystanie smFRET do monitorowania dynamiki białka w różnych stanach obciążenia nukleotydami.
- Rozwiązanie problemów związanych z etykietowaniem i unieruchamianiem białek w badaniach jednocząsteczkowych.
Zastosowane metody
- Technika smFRET (pojedynczy cząsteczkowy FRET).
- Strategie eksperymentalne w znakowaniu białek.
- Techniki immobilizacji w eksperymentach jednocząsteczkowych.
- Analiza dynamiki cyklu hydrolizy GTP.
Główne wyniki
- smFRET skutecznie monitoruje konformacje atlastyny.
- Różne stany obciążenia nukleotydami wpływają na dynamikę atlastyny.
- Rozwiązano problemy związane z znakowaniem i unieruchomieniem.
- Uzyskano wgląd w cykl hydrolizy GTP atlastyny.
Wnioski
- smFRET jest potężnym narzędziem do badania dynamiki białek.
- Zrozumienie zmian konformacyjnych atlastyny pomaga w pojęciu mechanizmów fuzji błon.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych wynikach w celu zbadania innych białek podobnych do dynaminy.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Obrazowanie smFRET (pojedynczych cząsteczek) atlastyny dostarcza bezpośredniego, ilościowego wglądu w dynamikę konformacyjną leżącą u podstaw fuzji błon napędzanej przez GTPazę, co jest procesem istotnym dla mechanizmów chorób neurodegeneracyjnych. Podejście to umożliwia wysokorozdzielcze badanie mechanochemicznej funkcji białek, zwiększając pewność predykcyjną w wczesnych etapach walidacji celów terapeutycznych i ograniczaniu ryzyka mechanistycznego. Precyzja tej metody w monitorowaniu zależnych od nukleotydów stanów konformacyjnych sprawia, że stanowi ona użyteczne narzędzie dla procesów odkrywania leków w biofarmacji, koncentrujących się na fuzji błon i biologii GTPaz.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią obserwację przejść konformacyjnych w GTPazach istotnych dla rozwoju chorób.
- Wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie stanu nukleotydowego z dynamiką strukturalną.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celu za pomocą analizy pojedynczych cząsteczek w czasie rzeczywistym.
- Zwiększa pewność prognostyczną przy selekcji celów fuzji błon w portfelu projektowym.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowane testy pojedynczych cząsteczek w celu uzyskania ilościowych odczytów konformacyjnych.
- Umożliwia powtarzalny pomiar dynamiki białek w określonych stanach nukleotydowych.
- Wspiera standaryzację testów dla późniejszego przesiewania modulatorów lub inhibitorów.
- Zapewnia platformę do skalowalnego, wysokotreściowego przesiewania mechanistycznego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje biomarkery konformacyjne z istotnymi dla choroby punktami końcowymi mechanizmu.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć molekularnych po przedkliniczną walidację funkcji GTPazy.
- Minimalizuje ryzyko decyzji dotyczących dalszego rozwoju dzięki dostarczeniu ilościowych dowodów mechanistycznych.
- Wspiera badania translacyjne nad rzadkimi zaburzeniami neurodegeneracyjnymi związanymi z dysfunkcją atlastyny.
Integracja potoków i przepływów pracy
Obrazowanie smFRET atlastyny wpisuje się w kontinuum odkryć – od wczesnych badań mechanistycznych, poprzez rozwój testów, aż po badania translacyjne, umożliwiając iteracyjne testowanie hipotez i walidację funkcjonalną.
- Biologia odkrywcza: dostarcza ilościowych dowodów na zmiany konformacyjne podczas hydrolizy GTP, wyjaśniając ścieżki mechanistyczne.
- Przesiewy: zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki FRET do analizy porównawczej stanów nukleotydowych i modulatorów.
- Analityka: generuje wysokotreściowe dane z pojedynczych cząsteczek do statystycznego porównania konformacji białek.
- Badania translacyjne: łączy dynamikę molekularną z fenotypami istotnymi dla chorób w procesach neurodegeneracji.
- Zastosowania przedsiębiorstw: oferuje modułową platformę do badania innych białek mechanochemicznych poza atlastyną.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy w analizach pojedynczych cząsteczek w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Dostarcza podstaw do decyzji go/no-go i zwiększa efektywność kapitałową poprzez ograniczanie ryzyka wczesnych celów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację programów związanych z fuzją błon oraz GTPazami w oparciu o analizę ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie fluorescencji pojedynczych cząsteczek oraz biochemii białek.
- Wymaga specjalistycznej aparatury, takiej jak mikroskopia TIRF i kamery EMCCD.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja protokołów znakowania i immobilizacji pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do innych białek mechanochemicznych może wymagać optymalizacji strategii znakowania.
- Przepustowość i analiza danych zależą od wydajnej infrastruktury obliczeniowej oraz dedykowanych skryptów.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:22
Preparation and Modification of Coverslips for Protein Immobilization in Chambers
4:12
Protein Biotinylation and Fluorophore Labeling for Single-Molecule Frster Resonance Energy Transfer (smFRET) Assays
6:41
Single-Molecule FRET Imaging and Data Analysis for GTP Hydrolysis Cycle of Atlastin
