Badania przesiewowe in vitro oparte na diodach LED do oceny fotoaktywowanych cząsteczek w inaktywacji fotodynamicznej bakterii
24 stycznia 2025
Ten protokół opisuje prostą i ekonomiczną metodę oceny skuteczności potencjalnych fotosensybilizatorów w antybakteryjnej inaktywacji fotodynamicznej (aPDI), przy użyciu formatu 96-dołkowej płytki w połączeniu ze źródłem światła na panelu LED. Takie podejście umożliwia jednoczesne testowanie wielu warunków eksperymentalnych, w tym różnych stężeń, związków i szczepów bakterii.
Moje badania koncentrują się na badaniu różnych cząsteczek z rodziny związków flavyliowych, zarówno naturalnych, jak i syntetycznych, z głównym zainteresowaniem badaniem ich bioaktywności w kontekście fotoprotekcji UV i oceną ich potencjału jako fotouczulaczy w zastosowaniach terapii fotodynamicznej. Ostatnie odkrycia naszej grupy badawczej wykazały aktywowane światłem właściwości barwników flawiliowych na bazie aminokwasów, ustanawiając je jako obiecującą nową klasę fotouczulaczy. Związki te wykazują znaczny potencjał do dalszych badań, torując drogę do innowacyjnych zastosowań w tej dziedzinie.
Korzystając z 96-dołkowego systemu mikropłytek i paneli świetlnych, możemy uzyskać wysokoprzepustowe badania przesiewowe fotouczulaczy w kontrolowanym środowisku, upraszczając identyfikację i porównanie różnych kandydatów do terapii fotodynamicznej. Na początek wprowadź bakterie Staphylococcus aureus na płytce agarowej Muellera-Hintona z kultury zatrzymanej. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny, aby uzyskać świeżą kulturę.
Zbierz dwie do trzech świeżych kolonii z płytki agarowej i rozcieńcz je w sześciu mililitrach wstępnie podgrzanego, sterylnego, przefiltrowanego PBS o pH 7,4. Wirować inokulum z prędkością 1 200 obrotów na minutę przez trzy do czterech cykli, aby homogenizować próbkę i pobrać trzy mililitry homogenizowanego inokulum do jednorazowej kuwety. Po zmierzeniu gęstości optycznej przy 600 nanometrach rozcieńczyć próbkę, aby dopasować ją do gęstości optycznej 0,1 za pomocą PBS.
Przygotować roztwór podstawowy związku fotouczulającego w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak DMSO lub PBS. Rozcieńczyć roztwór podstawowy w PBS, aby utworzyć roztwór roboczy, upewniając się, że składniki pożywek do hodowli bakteryjnych nie zakłócają absorpcji światła. Zwiruj roztwór roboczy, aby zapewnić całkowitą homogenizację.
Na początek przygotuj zawiesinę Staphylococcus aureus i roztwór roboczy związku fotouczulającego. Przygotuj dwie oddzielne płytki 96-dołkowe, jedną przeznaczoną do ekspozycji na światło, a drugą do kontroli ciemności. Na każdą płytkę wlej po 100 mikrolitrów roztworu fotouczulacza i zawiesiny bakteryjnej.
Wymieszaj roztwory od 5 do 10 razy za pomocą pipety. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, aby fotouczulacz mógł wejść w interakcję z komórkami bakteryjnymi. Po inkubacji wyjąć płytki z inkubatora.
Chroń jedną z płyt przed światłem jako ciemną kontrolkę. Umieść drugą 96-dołkową płytkę nad prostokątnym panelem LED o mocy 50 W. Zaznacz krawędzie płytki na powierzchni diody LED, aby zapewnić spójne rozmieszczenie w powtórzeniach protokołu.
Wystaw płytkę na działanie światła LED przez około 15 minut. Użyć innej 96-dołkowej płytki do przygotowania seryjnych rozcieńczeń próbek, w tym kontrolnych, studzienek nienapromieniowanych i napromieniowanych. Dodaj 180 mikrolitrów PBS do każdej studzienki, w zależności od liczby próbek.
Podwielokrotność 20 mikrolitrów z każdej studzienki w napromienionych i nienapromienionych płytkach do pierwszej kolumny płytki wypełnionej PBS. Za pomocą wielokanałowej mikropipety wykonaj proste rozcieńczenie szeregowe od studzienki 1 do 6. Podzielić płytkę agarową na sześć równych części, z których każda odpowiada jednemu z rozcieńczeń.
Podwielokrotność 10 mikrolitrów z każdej studzienki na odpowiednią sekcję płytki agarowej. Inkubować płytkę przez 18 do 20 godzin. Wyjąć płytkę agarową z inkubatora i zidentyfikować obszary odpowiednie do zliczania kolonii.
W każdej sekcji płyty ślimaka policz liczbę jednostek tworzących kolonię. Widmo światła widzialnego wykazało trzy wyraźne piki od 400 do 700 nanometrów. W ciemnych warunkach żaden z badanych związków flawiliowych nie wykazywał działania cytotoksycznego.
Natomiast po ekspozycji na światło badane związki powodowały zależny od dawki spadek żywotności Staphylococcus aureus z istotnymi efektami obserwowanymi przy stężeniach 6 i 12 mikromolowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje ekonomiczną metodę oceny skuteczności fotouczulaczy w antybakteryjnej fotodynamicznej inaktywacji (aPDI) z wykorzystaniem płytek 96-dołkowych i panelu LED. Technika ta umożliwia jednoczesną ewaluację różnych warunków eksperymentalnych, w tym różnych stężeń, związków oraz szczepów bakteryjnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biochemia
- Terapia fotodynamiczna
Wstęp
- Badania koncentrują się na związkach flawylu w kontekście fotoprotekcji UV.
- Analiza ich bioaktywności jako fotosensybilizatorów.
- Najnowsze odkrycia podkreślają potencjał barwników flawylowych na bazie amin.
- Przesiewy wysokoprzepustowe upraszczają ocenę kandydatów.
Cel badania
- Ocena skuteczności różnych fotouczulaczy.
- Identyfikacja obiecujących związków do zastosowania w terapii fotodynamicznej.
- Pogłębienie wiedzy na temat przeciwbakteryjnej inaktywacji fotodynamicznej.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie mikropłytki 96-dołkowej do testowania.
- Zastosowanie panelowego źródła światła LED.
- Inokulacja Staphylococcus aureus na agarze Mueller-Hintona.
- Inkubacja w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny.
Główne wyniki
- Identyfikacja skutecznych fotouczulaczy.
- Demonstracja właściwości aktywowanych światłem barwników flawylium.
- Wyniki wysokoprzepustowego przesiewu umożliwiające efektywne porównanie kandydatów.
- Potencjał do innowacyjnych zastosowań w terapii fotodynamicznej.
Wnioski
- Opracowano prostą metodę oceny fotouczulaczy.
- Związki flawyliowe wykazują potencjał do dalszych badań.
- Podejście to może prowadzić do postępów w terapiach przeciwbakteryjnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie w przemyśle
Wysokoprzepustowy screening in vitro oparty na diodach LED umożliwia szybką ocenę cząsteczek fotoaktywowalnych pod kątem przeciwbakteryjnej foto dynamicznej inaktywacji, odpowiadając na pilne potrzeby związane z antybiotykoopornością. Platforma ta wspiera wczesną selekcję kandydackich fotosensybilizatorów, dostarczając standaryzowanych, powtarzalnych i ilościowych danych dotyczących przeżywalności. Integracja takiego screeningu z procesami odkrywania przyspiesza identyfikację obiecujących związków do dalszego rozwoju translacyjnego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia systematyczną ocenę skuteczności fotosensybilizatorów przeciwko celom bakteryjnym.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez rozróżnienie cytotoksyczności zależnej od światła od toksyczności w ciemności.
- Ułatwia uzyskanie pewności prognostycznej w wyborze kandydatów dzięki ilościowym danym dotyczącym redukcji żywotności.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia wysokoprzepustową, zestandaryzowaną ocenę wielu związków i stężeń w trybie równoległym.
- Gwarantuje powtarzalność i porównywalność serii eksperymentalnych dzięki zastosowaniu kontrolowanego oświetlenia LED oraz formatu mikropłytek.
- Generuje ilościowe wyniki (jednostki tworzące kolonie), co pozwala na rzetelne rankingowanie związków i optymalizację analizy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z celami translacyjnymi poprzez identyfikację kandydatów o silnej, aktywowanej światłem aktywności przeciwbakteryjnej.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania do walidacji przedklinicznej, umożliwiając określanie zależności dawka-odpowiedź oraz profilowanie selektywności.
- Wspiera podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju nowych metod przeciwdziałania infekcjom w oparciu o analizę ryzyka.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Ta oparta na diodach LED metoda przesiewowa znajduje zastosowanie na etapie przejścia między wczesnym odkrywaniem a identyfikacją wiodących związków dla przeciwbakteryjnych agentów fotodynamicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących cytotoksyczności aktywowanej światłem oraz mitygację ryzyka mechanistycznego w przypadku cząsteczek kandydackich.
- Przesiewy: Zapewnia gotowość i powtarzalność testów dla skalowalnej oceny związków.
- Analityka: Umożliwia ilościowe pomiary żywotności bakterii oraz efektów zależnych od dawki.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkrywania z oceną przedkliniczną poprzez identyfikację kandydatów o potencjale translacyjnym.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje elastyczną, wielokrotnego użytku platformę, którą można dostosować do różnych klas fotosensybilizatorów i szczepów bakteryjnych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną we wczesnej fazie odkrywania środków przeciwinfekcyjnych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy oraz umożliwia przeprowadzanie powtarzalnych i skalowalnych kampanii przesiewowych.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową poprzez koncentrację zasobów na zwalidowanych kandydatach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój nowych modalności przeciwbakteryjnych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu mikrobiologii, fotochemii oraz projektowania analiz ilościowych.
- Wymaga dostępu do skalibrowanych paneli LED, czytników mikropłytek oraz infrastruktury do pracy w warunkach sterylnych.
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji naświetlania, obsługi płytek oraz protokołów analizy danych.
- Możliwość adaptacji do różnych szczepów bakteryjnych i chemotypów fotosensybilizatorów po optymalizacji protokołu.
- Potencjalne ograniczenia obejmują rozpuszczalność związków, penetrację światła oraz interferencje ze strony składników pożywek.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:57
Preparation of Culture and Compounds for Evaluating Photodynamic Activity of Photosensitizers Against Antibiotic-Resistant Bacteria
2:18
In Vitro Photodynamic Inactivation Assay for Bacteria: High-Throughput Testing of Photosensitizers Using LED Illumination
4:37
Representative Results
